Методы определения антигельминтиков в органах и тканях животных

Глава 6

6.1. Бензимидазолы

Оксфендазол. Оксфендазол и продукты его метаболизма в органах и тканях животного происхождения обнаруживали методом жидкостной хроматографии высокого давления (С.Ф. Ожи-гина, Т.С. Новик, 1991).

Методика основана на извлечении оксфендазола и его метаболитов из гомогената анализируемых проб этилацетатом, очистке экстракта перераспределением в системе ацетонитрил-гексан и количественном определении методом жидкостной хроматографии высокого давления с использованием в качестве внутреннего стандарта раствора мебендазола. Чувствительность метода — 0,05 мг/кг, определяемость — 80±5 %.

Реактивы и растворы. Физиологический раствор. 25%-ный раствор аммиака. Бромистый калий (КВг). Этилацетат х.ч. Ацетонитрил х.ч. Гексан х.ч. Диметилсульфоксид (ДМСО) х.ч. 0,05 М раствор углекислого аммония ((NH4)2CO3) 4,5 г/л). Стандартный раствор мебендазола с концентрацией 500 мкг/мл (50 мг препарата растворяют в 100 мл ДМСО).

Приборы и посуда. Гомогенизатор. Ротационный вакуумный испаритель. Весы аналитические. Делительные воронки емкостью 25 мл или цилиндрические пробирки с притертой пробкой емкостью 25 мл. Круглодонные колбы емкостью 25 и 50 мл. Мерные цилиндры емкостью 50 и 100 мл. Автоматические пипетки на 100 мкл и 5 мл. Пробирки Эппендорфа на 0,5 мл. Жидкостной хроматограф типа НРР 5001 (ЧССР). Настольная центрифуга типа ОПн-8УХЛ4.2.

Ход анализа. Анализируемую пробу животной ткани (мышцы, печень, почки, селезенка и др.) измельчают и делают навеску в 2 г. Измельченную пробу гомогенизируют в 10 мл физиологического раствора. В гомогенат вносят 2 г КВг и 1 каплю 25%-ного раствора аммиака. Добавляют 10 мл этилацетата, осторожно перемешивают, не допуская образования эмульсии. Органическую фазу переносят в круглодонную колбу. Переэкстракцию повторяют дважды. Этил ацетатные экстракты объединяют в круглодонной колбе и упаривают в ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C досуха. Сухой остаток растворяют в 10 мл ацетонитрила и переносят в цилиндрическую пробирку с притертой пробкой. Добавляют 10 мл гексана и осторожно встряхивают. После разделения слоев гексановый слой отбрасывают. Переэкстракцию повторяют трижды. Ацетонитрильный слой переносят в круглодонную колбу и упаривают при температуре не выше 40 °C досуха. В колбу вносят 200 мкл ДМСО и 100 мкл раствора мебендазола, используемого в качестве внутреннего стандарта. Остаток растворяют и переносят в пробирку Эппендорфа. Пробы до анализа хранят при ~ 20 °C.

Условия хроматографического анализа. Жидкостной хроматограф высокого давления типа НРР 5001 (ЧССР). Колонка с Se-paron С-18 (5 мкм) длиной 150 мм и внутренним диаметром 3,3 мм. Подвижная фаза: ацетонитрил — 0,05 М раствор (NH4)2CO3 в соотношении 33 : 65 (объем/объему). Скорость подвижной фазы 0,4 мл/мин. Давление 22 мРа. Объем вводимой в хроматограф пробы 5-8 мкл. Длина волны анализа 290 нм. Время удерживания: оксфендазол — 5’0”, сульфон оксфендазола — 8’20”, мебендазол-12’30”.

Обработка результатов анализа. Содержание оксфендазола и его метаболитов в анализируемой пробе рассчитывают по формуле

где X — содержание оксфендазола и его метаболитов в анализируемой пробе, мкг/г или мг/кг; — площадь пика внутреннего стандарта (мебендазола), мм2S2 — площадь пика оксфендазола и его метаболитов, мм2; С — количество внутреннего стандарта в пробе, вносимой в хроматограф, мкг или мг; Ki — объем пробы, вносимой в хроматограф (5 или 8 мкл); К2 ” общий объем пробы (300 мкл); Р — масса анализируемой пробы, г или кг.

Хроматографический метод количественного анализа албен-дазола и албендазола сульфоксида в пробах животного происхождения с нижним пределом измерения для печени 125,691, почек — 121,743 нг/г разработан С.Н. Максименко (2007). Методика обеспечивает выполнение измерений с суммарной погрешностью ±5 % при доверительной вероятности — 0,95. Метод основан на извлечении албендазола и албендазола сульфоксида из гомогената анализируемых проб этилацетатом, очистке экстракта перераспределением в системе ацетонитрил — гексан и количественном определении методом жидкостной хроматографии высокого давления.

Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы, реактивы. Средства измерения: жидкостной хроматограф высокого давления Helwett-Packard 1090 с диодно-матричным детектором, управляемым при помощи 79994A Chem Station; весы аналитические 2-го класса точности, ГОСТ 24104-88; весы микроаналитические, точность взвешивания до 4-го десятичного знака, Chen (США) или аналогичные; автоматические пипетки, ТУ 64-1-3329-81; колбы мерные вместимостью 100 мл, ГОСТ 1770-74; шприц Гамильтона (Швейцария).

Вспомогательные устройства: холодильник; роторный испаритель; сушильный шкаф; цилиндрические пробирки с притертой пробкой емкостью 50 мл; круглодонные колбы емкостью 25 и 50 мл; пробирки на конус (Эппендорфа на 1 или 0,5 мл); стандартные образцы албендазола фирмы Invesa. Активность 99,7 %.

Реактивы: этилацетат х.ч.; ацетонитрил х.ч.; гексан х.ч.; диме-тилформамид (ДМФА) х.ч.; сульфат натрия (Na2SO4) безводный.

Требования безопасности:

1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005-88;

2. При проведении анализов горючих и вредных веществ соблюдают меры противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-76;

3. При выполнении измерений с использованием хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

К выполнению измерений и обработке результатов допускают лиц с высшим и средним специальным образованием, имеющих навыки работы с химическими реагентами и на жидкостном хроматографе.

Приготовление растворов и подготовку проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха 20±10 °C, атмосферном давлении 84-106 кПа и влажности воздуха не более 80 %. Измерения на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Стандартный раствор албендазола с концентрацией 20000 нг/см3 (раствор № 1) готовят путем растворения точной навески стандартного образца в диметил формамиде. Раствор хранится в течение 14 сут в холодильнике. Рабочие стандартные растворы албендазола готовят путем последовательного разведения диме-тилформамидом до концентраций 10000, 5000, 2500, 1000, 500 нг/мл.

Общую подготовку прибора осуществляют согласно инструкции по эксплуатации.

Параметры хроматографирования: Жидкостной хроматограф высокого давления Helwett-Packard 1090 с диодноматричным детектором, управляемым при помощи 79994А ChemStation. Элюент: ацетонитрил/аммонийно-ацетатный буфер (40/60). Колонка хроматографическая: Micra С 18 ODS (2,0×40,0 мм) с размером сорбента 1,5 цт. Скорость протекания элюента -1,0 мл/мин. Давление: 16,2 МПа. Объем вводимой пробы — 0,050 мл. Длина УФ-волны детектирования: 290 нм. Время удерживания албендазола: — 7,5 мин. Время удерживания албендазола сульфоксида: — 6,5 мин.

Статистическая обработка результатов анализа проб печени и почек. По результатам анализа стандартных концентраций албендазола построили график зависимости площади пика от концентрации (рис. 6.1.).

Площадь пика,

mVxS

Концентрация,

нг/см3

421,043

20000

198,804

10000

123,001

5000

53,454

2500

18,166

1000

12,872

500

0

0

 

Рис. 6.1. Площадь пика-концентрация (стандартные растворы)

В результате было получено следующее уравнение, отражающее данную зависимость:

Y— 47,526 x X

Для определения процента извлечения албендазола в образцы, отобранные от животных контрольной группы, искусственно внесли стандартные растворы албендазола и албендазола сульфоксида из расчета 2500 нг/г биосубстрата. Результаты анализа данных образцов приведены в таблице 6.1.

6.1. Степень извлечения албендазола из экстрактов печени и почек

Биосубстрат с албендазолом

Площадь пика стандарта албендазола

Площадь пика албендазола в экстракте

Извлечение, %

Печень

 

53,454

42,528

79,56

Почки

43,907

82,14

Подготовка проб к определению. Экстракция и очистка экстрактов, органы и ткани. До проведения анализа пробы хранят при — 20 °C. Анализируемую пробу животной ткани (печень, легкие, сердце, мышцы и др.) размораживают, измельчают тщательно ножницами, взвешивают и переносят в цилиндрическую пробирку с притертой пробкой, добавляют 20-30 мл этилацетата и оставляют на 10-12 ч. Затем экстракт переносят через бумажный фильтр с безводным сульфатом натрия в круглодонную колбу. Навеску пробы заливают второй порцией этилацетата (10-20 мл) и оставляют на 1 ч при периодическом встряхивании, экстракт также переносят через бумажный фильтр с безводным сульфатом натрия в круглодонную колбу.

Этилацетатный экстракт упаривают в ротационном испарителе досуха при температуре 40-50 °C. Сухой остаток дважды смывают 10 мл ацетонитрила и переносят в другую пробирку с притертой пробкой емкостью 50 мл. В пробирку добавляют 15 мл гексана, содержимое осторожно переворачивают примерно 30 раз. После разделения слоев автоматической пипеткой (5 мл) верхний гексановый слой отсасывают и отбрасывают. Переэкс-тракцию повторяют трижды, во всех случаях гексановый слой отбрасывают. Нижний ацетонитрильный слой количественно переносят в кругло донную колбу емкостью 25 мл. Органический растворитель отгоняют в ротационном испарителе при температуре 40 °C досуха. В колбу вносят 200 мкл диметилформамида (ДМФА), остаток растворяют и переносят в пробирки Эппендор-фа. Пробы до анализа хранят при — 20 °C.

Хроматографирование полученных экстрактов проводили вышеописанным методом.

Выполнение измерений. Анализ включает не более 10 испытуемых образцов. Перед началом и в конце работы проводят анализ стандартного образца, чтобы убедиться в стабильности работы системы. Объем наносимой на колонку пробы для всех объектов составляет 0,050 мл.

Обработка результатов. Для обработки результатов хроматографирования используется программа «DataBase Biostatistic 4.02 vs». На хроматограммах исследуемых образцов определяют площадь пиков, по времени удерживания соответствующих пикам стандарта албендазола.

По калибровочному графику находят содержание албендазола в объеме инжектируемой пробы испытуемого образца.

6.2. Площадь пика-концентрация (стандартные растворы)

Содержание албендазола рассчитывают по формуле

где Ска — концентрация албендазола в образце, нг/г; 5 — значение площади пика с хроматограммы (%); К — коэффициент, учитывающий степень извлечения албендазола (получен при постановке модельных опытов с внесением известных количеств албендазола сульфоксида), для печени — 59,736048, почек — 57,859751; т — масса навески печени или почек

Содержание албендазола сульфоксида определяют пересчетом, исходя из молекулярной массы, по формуле

где Скс — концентрация албендазола сульфоксида в образце, нг/г; Ска -концентрация албендазола в образце, нг/г; Мс — молекулярная масса албендазола сульфоксида (281,3); Ма — молекулярная масса албендазола (265,3)

Фенбендазол. С.В. Русаков, П.П. Диденко, Зуев (2006 ) разработали метод определения остаточных количеств фенбендазола и его метаболита — оксфендазола, который является основным противопаразитарным агентом, в органах и тканях свиней после обработки препаратом Фензол (новая лекарственная форма анти-гельминтика на основе фенбендазола, разработанная ВИГИС, П.П. Диденко).

При разработке методики за основу взяты широко используемые методы экстракции и очистки проб (S. Marriner, J. Bogan 1980; Р. Delatour, 1983), параметры хроматографирования были подобраны в процессе работы с учетом особенностей имеющегося хроматографа, хроматографической колонки и реактивов.

Принцип метода. Метод основан на хроматографировании с использованием жидкостного хроматографа высокого давления с ультрафиолетовым детектором, обращеннофазовой колонки и программы Мультихром (версия 1.5), достаточного для анализа количества экстрактов, полученных после экстракции этилацета-гом проб плазмы крови, печени, почек, сердца, поджелудочной железы, легких, селезенки, мышечной ткани, жировой ткани, лимфоузлов, матки, тонкого и толстого кишечника, очистки экстрактов в системе «ацетонитрил-гексан» и концентрирования очищенных экстрактов.

Оборудование, посуда, реактивы: стандарт фенбендазола с активностью 99,8 % («Jangsu Jabang Group»); стандарт оксфендазола с активностью 95,4 % («Jangsu Jabang Group»); жидкостной хроматограф высокого давления Hewlett Paccard 1090 А с УФ-детектором или аналогичный по техническим характеристикам; хроматографическая обращеннофазовая колонка LUNA С 18 (250 х 4,6 мм) с диаметром сорбента 5 мкм или аналогичная; весы лабораторные, ГОСТ 24104; pH-метр Hanna pH 213; вакуумный ротационный испаритель IKA RV 06 ML 1-В или аналогичный по техническим характеристикам; центрифуга лабораторная ОПН-3 или аналогичная; ультразвуковая ванна Branson В 8510 DTH или аналогичная; встряхиватель Elmi (Шейкер S-3.01) или аналогичный; посуда мерная, лабораторная стеклянная, ГОСТ 1770; вода дистиллированная, ГОСТ 6709; бромид калия 99,0 %,  Р0838 («Sigma»); углекислый аммоний двузамещенный А 9516 («Sigma»); водный раствор аммиака 30 % 22,122-8 («Sigma-Aldrich»); этилацетат х.ч., ГОСТ 22300-76 («Борис Авогадро»); ацетонитрил, ч.д.а., ТУ 6-09-5497 («Криохром»); гексан, ч., ТУ 6-09-337578 (АО «Мосреактив»),

Подготовка к анализу. Приготовление элюента. 0,05 М раствор углекислого аммония (4,8045 г/1000 мл воды) смешивали с ацетонитрилом в соотношении 65 : 35 и фильтровали через бумажный фильтр непосредственно перед использованием.

Настройка хроматографа. Для ввода хроматографической системы в рабочий режим колонку LUNA С 18 (250 х 4,6 мм) промывали элюентом в количестве 15 свободных объемов колонки при скорости протекания элюента 0,3 см3/мин. После окончательного уравновешивания колонки устанавливали УФ-волну анализа на 290 нм.

Приготовление рабочих стандартных растворов. На аналитических весах взвешивали по 10,0 мг (точные навески с учетом активности) фенбендазола и оксфендазола, навески переносили в общую мерную колбу объемом 100 см3, добавляли 50 см3 элюента и тщательно перемешивали до полного растворения. Затем объем раствора водой доводили до метки. Полученная концентрация исходного раствора — 100 мкг/см3 по каждому из компонентов. Из исходного раствора методом последовательных разведений готовили стандартные растворы с концентрацией 10; 5; 2,5 и 1 мкг/см3 по фенбендазолу и оксфендазолу.

Подготовка проб к анализу. В образцы (плазма крови, печень, почки, сердце, поджелудочная железа, легкие, селезенка, мышечная ткань, жировая ткань, лимфоузлы, матка, тонкий и толстый кишечник) массой 5 г добавляли 10 см3 физиологического раствора и гомогенизировали в течение 3-5 мин при 5000 об/мин.

Полученный гомогенат количественно переносили в делительную воронку и помещали в резервуар со льдом. В охлажденный гомогенат вносили 2 г бромида калия и титровали pH до 8-9 при помощи 25%-ного водного аммиака, после чего пробу тщательно перемешивали. Далее, к гомогенату добавляли 10 см3 этилацетата, пробу экстрагировали при постоянном перемешивании в течение 1 ч. Затем для разделения слоев полученную эмульсию центрифугировали в течение 5 минут при 5000 об/мин. Экстракцию каждой пробы этилацетатом с последующим центрифугированием проводили трехкратно. После центрифугирования слои этилацетата переносили в круглодонную колбу для последующего упаривания. Объединенные этилацетатные экстракты упаривали досуха на ротационном испарителе при температуре +40 °C. Полученный после упаривания сухой остаток растворяли в 10 см3 ацетонитрила при одновременной обработке ультразвуком. Ацетонитрильный раствор переносили в пробирку объемом 25 см3 и промывали 3-5-кратно порциями по 8 см’ гексана. Гексановые фракции отбрасывали, а ацетонитрильную фракцию, промытую гексаном, переносили в круглодонную колбу объемом 50 см3 и упаривали досуха на ротационном испарителе при температуре +50°С. Полученный после упаривания сухой остаток растворяли в 0,5 см3 элюента при одновременной обработке ультразвуком для последующего анализа методом жидкостной хроматографии высокого давления.

Параметры хроматографирования. Наиболее оптимальные результаты анализа были получены при следующих хроматографических параметрах:

Обращеннофазовая хроматографическая колонка LUNA С 18 (250 х 4,6 мм) с диаметром сорбента 5 мкм. Элюент: ацетонит-рил/0,05 М раствор углекислого аммония в соотношении 35/65. Скорость протекания элюента —  0,5 см3/мин. Давление: 18,4 МПа. Объем вводимой пробы — 50 мкл. Спектр УФ-волны: 290 нм.

Определение метрологических характеристик метода. Для проведения качественного и количественного анализа полученных экстрактов применяли процедуру градуировки хроматографических данных в компьютерной программе «Мультихром 1.5».

Для построения графика корреляции площади пика и концентрации использовали ряд стандартных разведений фенбенда-зола и оксфендазола 10; 5; 2,5 и 1 мкг/см3, приготовленных по схеме, приведенной выше. Результаты, полученные при определении корреляции «площадь пика/концентрация» представлены в таблице 6.2.

6.2. Зависимость площади пика от концентрации

Площадь пика фенбендазола

Концентрация стандартного раствора фенбендазола, мкг/см3

Площадь пика оксфендазола

Концентрация стандартного раствора оксфендазола, мкг/см3

914,858

 

10

869,341

 

10

912,830

854,220

474,558

 

5

443,089

 

5

464,367   1

452,101

235,690

 

2,5

222,013

 

2,5

232,999

238,608

92,721

 

1

85,553

 

1

90,640

88,269

Уравнения, полученные для линий тренда фенбендазола и оксфендазола, и в частности, величины достоверности аппроксимации (R2), приближенные к единице, свидетельствуют о высокой степени линейной зависимости площади пика от концентраций компонентов и, следовательно, о высокой достоверности получаемых результатов (рис. 6.2).

Рис. 6.2. Калибровочный график

Определение уровня извлечения фенбендазола и оксфендазо-ла из проб. Определение уровня извлечения фенбендазола и окс-фендазола проводили на контрольных пробах. В плазму крови объемом 2 см3, а также гомогенаты проб органов и тканей массой 5 г вносили по 1см3 стандартного раствора фенбендазола и окс-фендазола с концентрацией 5 мкг/см3. После внесения стандартных растворов пробы тщательно перемешали. Пробоподготовку проводили по отработанной методике. Объем конечных экстрактов модельных проб составлял 1 см3. Результаты определения уровней представлены в таблицах 6.3 и 6.4.

Определение пределов детектирования. Пределы детектирования фенбендазола и оксфендазола в экстрактах определяли хроматографированием модельных проб плазмы крови, печени, почек, сердца, поджелудочной железы, легких, селезенки, мышечной ткани, жировой ткани, лимфоузлов, матки, тонкого и толстого кишечника с внесенными стандартными образцами различной концентрации.

6.3. Определение уровня извлечения фенбендазола (концентрация 5 мкг/см3, площадь стандарта 469,462)

Проба

Площадь пика фенбендазола в пробе

Уровень извлечения, Кэ

Плазма

358,297

0,76

Печень

361,559

0,77

Почки

353,903

0,75

Мышцы

340,112

0,72

Сердце

372,647

0,79

Легкие

377,505

0,80

Матка

370,734

0,79

Жировая ткань

379,298

0,81

Поджел. железа

404,524

0,86

Селезенка

388,315

0,83

Лимфоузел

371,200

0,79

Тонкая кишка

375,471

0,80

Толстая кишка

389,227

0,83

6.4. Определение уровня извлечения оксфендазола (концентрация 5 мкг/см3, площадь стандарта 447,595)

Проба

Площадь пика оксфендазола в пробе

Уровень извлечения, Кэ

Плазма

412,068

0,92

Печень

402,219

0,90

Почки

395,217

0,88

Мышцы

420,310

0,94

Сердце

388,775

0,87

Легкие

405,308

0,91

Матка

403,609

0,90

Жировая ткань

415,008

0,93

Поджел. железа

427,034

0,95

Селезенка

420,611

0.94

Лимфоузел

382,102

0,85

Тонкая кишка

399,648

0,89

Толстая кишка

419,500

0,94

В результате получили следующие значения пределов тестирования фенбендазола и оксфендазола в экстрактах (нг/г)

Фенбендазол

плазмы крови

1

печени

10

почек

10

поджелудочной железы

10

мышц

10

ткани сердца

15

ткани легких

15

кожи

10

жира

10

селезенки

20

лимфоузла

20

матки

20

тонкой кишки

10

толстой кишки

15

Оксфендазол

плазмы крови

15

печени

10

почек

10

поджелудочной железы

10

мышц

10

ткани сердца

15

ткани легких

15

кожи

10

жира

10

селезенки

15

лимфоузла

15

матки

10

тонкой кишки

10

толстой кишки

15

При помощи процедуры градуировки, выполненной в соответствующем разделе компьютерной программы «Мультихром 1.5», определяют относительные коэффициенты отклика детектора для анализируемых экстрактов и получают формулы расчета содержания фенбендазола и оксфендазола в экстрактах (Y)

Фенбендазол

плазмы крови                        0,0573684 х X

печени

0,0566233 хХ

почек

0,0581333 хХ

поджелудочной железы

0,0483552 х X

мышц

0,0501149 хХ

ткани сердца

0,0468817 хХ

ткани легких

0,0519047 хХ

кожи

0,0566233 хХ

жира

0,0506976 х X

селезенки

0,0454166 хХ

лимфоузлов

0,0558974 хХ

матки

0,0534260 х X

тонкой кишки

0,0531707 хХ

толстой кишки

0,0566350 хХ

Оксфендазол

плазмы крови

0,0404677 х X

печени

0,0501390 хХ

почек

0,0435276 хХ

поджелудочной железы

0,0422904 х X

мышц

0,0421821 хХ

ткани сердца

0,0510299 хХ

ткани легких

0,0534517 хХ

кожи

0,0590012 хХ

жира

0,0526741 хХ

селезенки

0,0432290 х X

лимфоузла

0,0529782 х X

матки

0,0517114 хХ

тонкой кишки

0,0424335 хХ

толстой кишки

0,0545578 хХ

6.2. Ивермектины

Для любого ветеринарного препарата необходим метод его обнаружения в органах и тканях леченых животных с целью установления сроков ожидания, после чего можно использовать продукты в пищу человеку. Для ивермектина, применяемого в микродозе 0,2 мг/кг необходим был очень точный метод обнаружения. J.W. Tolan et al. (1980) разработали реакцию ароматизации, которая приводила к флуоресценции деривата авермектина в плазме, что позволило обнаружить препарат в незначительных количествах. В 1981 г. метод высокочувствительной жидкостной хроматографии (ВЖХ) с флуоресцентным детектированием был успешно использован Р.С. Tway, J.S. Wood, G.V. Downing (1981) для определения концентрации препарата в органах и тканях различных видов животных. Чувствительность этого метода была равной 1 нг/г.

Флуоресцентная дериватизация была использована другими исследователями для анализа ивермектина в плазме с применением более современных адсорбентов и средств выделения (S.E. Marriner et al., 1987; К. Kojima et al., 1987). С разработкой более чувствительного ультрафиолетового детектора метод ВЖХ был усовершенствован для определения ивермектина в крови при чувствительности 2 нг/мл (J.V. Pivnichny et al., 1983). Метод жидкостной хроматографии и ультрафиолетового обнаружения при чувствительности 4-5 нг/мл является удобным методом для обнаружения дигидроавермектина В и дигидроавермектина В1б. Этот метод используется для определения препарата в молоке коров при чувствительности 2 нг/мл (М. Alvinerie et al., 1987).

Для изучения метаболизма ивермектина в организме животных N.E. Weber (1980), H.W. Dorough (1980) разработали радиометрический метод обнаружения препарата. Препарат метаболизируется незначительно. Основная часть препарата обнаруживается в виде основного компонента авермектина В]а (H2Bia). Концентрация этой фракции в 10-20 раз выше содержания фракции авермектина Bi6 (H2Bi6). В связи с этим компонент авермектина Bia является как бы маркером и основным при определении остаточных количеств ивермектина.

Наиболее точным и надежным методом изучения фармакокинетики и остаточных количеств ивермектина в продуктах животного происхождения является метод жидкостной хроматографии высокого давления (ВЖХ) с флуоресцентным детектированием после проведения дериватизации (J.A. Bogan, Q.A. McKeller, 1988; С.В. Русаков, 1997).

Принцип метода основан на извлечении препарата из анализируемых проб мяса и органов этилацетатом, отгонке растворителя, очистке экстракта в системе ацетонитрил-гексан и на концентрирующих патронах Диапак-С-16 и Диапак-Амин с последующим определением жидкостной хроматографией высокого давления с флуоресцентным детектированием после дериватизации. Чувствительность метода — 4 нг/г.

Реактивы и растворы: этилацетат, х.ч.; гексан, х.ч.; концентрирующие патроны Диапак-С-16 и Диапак-Амин («БиоХим-Мак»); метанол, х.ч.; 1-метилимидазол, х.ч.; стандартный раствор ивермектина в метаноле с концентрацией 0,08 мкг/мл (0,00008 мг/мл).

Приборы и посуда: жидкостной хроматограф высокого давления типа Ди Pont 8800 (США) с флуоресцентным детектором Kratos Sthaeffel FS 950 (Великобритания); вакуумный ротационный испаритель; вакуумный испаритель со смесителем Vortex; баня для охлаждения; баня водяная с подогревом; ультразвуко-войдиспергатор УЗДН-1М; ротационный испаритель; аналитические весы; плоскодонные колбы с притертой пробкой емкостью 100 мл; круглодонные колбы со шлифом емкостью 50 мл; воронки химические; пробирки с притертой пробкой емкостью 30-40 мл; пробирки конусообразные емкостью 1 мл; автоматические пипетки на 5; 1 и 0,5 мл.

Ход анализа. Пробы мышц, печени, сердца, жира, почек, легких массой по 2 г и молока и крови по 2 мл, взятые у разных групп животных по 3-5 голов в каждой до и через 2, 4, 8, 12, 16 и 20 сут после введения препарата в дозе 0,2 мг/кг измельчали ножницами или в гомогенизаторе, помещали в плоскодонную колбу емкостью 100 мл, заливали 20 мл этилацетата и оставляли на сутки (тождественно экстракции при постоянном встряхивании в течение 1 ч). Экстракт переносили через воронку с фильтровальной бумагой, заполненную на 1/3 безводным, в круглодонную колбу емкостью 50 мл. Далее пробы повторно заливали 20 мл этилацетата и экстрагировали в течение 1 ч при постоянном встряхивании. Экстракты объединяли в круглодонной колбе, после чего упаривали досуха на роторном испарителе. Сухой остаток растворяли в 10 мл ацетонитрила и переносили в делительную воронку или пробирку с притертой пробкой. Экстракт промывали 4-5 раз порциями гексана по 10 мл. Гексановые фракции отбрасывали. Ацетонитрильный экстракт переносили в круглодонную колбу емкостью 50 мл и упаривали досуха. Сухой остаток растворяли в 5 мл ацетонитрила, после чего добавляли 10 мл дистиллированной воды.

Полученную ацетонитрильно-водную фракцию (1:2) наносили на патрон Диапак-С-16, предварительно последовательно активированный 5 мл ацетонитрила и 10 мл воды. Препараты элюировали с патрона Диапак-С-16 20 мл ацетонитрила через патрон Диапак-Амин, предварительно активированный 5 мл ацетонитрила, в круглодонную колбу. Элюент упаривали досуха на роторном испарителе.

Далее сухой остаток растворяли при флуоресцентном детекторе в 1 мл ацетонитрила.

Проведение дериватизации. В пробирку с сухим остатком вносили 0,5 мл ацетонитрила, энергично встряхивали и обрабатывали ультразвуком в течение 30 с. Затем пробирку повторно встряхивали и повторно обрабатывали ультразвуком, чтобы полностью перевести в раствор авермектины, адсорбированные на стенках пробирки.

Необходимо следить, чтобы в образцы перед проведением дериватизации не попала влага.

В пробирку с подготовленным ацетонитрильным раствором после растворения вносили с помощью градуированной микропипетки 0,05 мл 1-метилимидазола. Пробирку закрывали, тщательно перемешивали содержимое в течение 5-10 с, обрабатывали ультразвуком, центрифугировали и помещали в холодильник при 0 °C на 10-15 мин. Готовили реакционную смесь из трифторуксусного ангидрида и ацетонитрила в соотношении 1 : 2 и помещали ее в холодильник при 0 °C на 10-15 мин.

После охлаждения в пробирку с образцом вносили 0,150 мл охлажденной реакционной смеси. Пробирку закрывали, перемешивали содержимое, обрабатывали ультразвуком, центрифугировали и выдерживали в холодильнике в течение 1 ч.

Условия хроматографирования проб с авермектином и обработка результатов: жидкостной хроматограф Ди Pont 8800 (США) с флуоресцентным детектором Kratos-Sthaeffel FS 950 (Англия); металлическая колонка Диасорб-130-С 16Е 250×4 мм, 6 мм («БиоХимМак», Россия); подвижная фаза метанол:вода (98 : 2); скорость подвижной фазы 2 мл/мин.; длина волн возбуждения 365, эмиссии 470 нм; время удерживания H2Bi6 16,6, H2Bia 18,6 мин.

Содержание авермектина в анализируемых пробах рассчитывали по формуле (1), где X- содержание авермектина в анализируемой пробе, нг/г; 5) — площадь пиков фракции H2Bia в стандарте, мм2S2 — площадь пиков фракции Н2В]6 в пробе, мм2С —количество стандарта в пробе, вносимой в хроматограф, нг; V —объем пробы, вносимой в хроматограф (50 мкл); К2 — общий объем пробы (0,7 мл); Р — масса анализируемой пробы, г.

Для изучения фармакокинетики ивермектина разработаны разные методы его выявления в органах и тканях, сыворотке кро-

ви и молоке. Однако многие методы из-за своей сложности и недостаточной чувствительности малоэффективны.

А.В. Григорьев и др. (2004) разработали методику определения ивермектина в сыворотке крови животных и продуктах ветеринарно-санитарного надзора после применения различных лекарственных форм на основе ивермектина.

Метод определения концентрации ивермектина в крови и молоке животных основан на определении количественного содержания флуоресцентного производного ивермектина с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке с обращенной фазой с применением флуоресцентного детектора.

Подготовка проб заключается в экстракции ивермектина органическим растворителем из исследуемого образца животного происхождения, очистке путем твердофазной экстракции и получении флуоресцентного производного ивермектина обработкой трифторуксусным ангидридом в присутствии 1 -метил-имидазола.

Детектирование ведется по интенсивности флуоресценции при длинах волн возбуждения и эмиссии 365 и 470 нм, соответственно. Чувствительность метода составляет 2 нг в пробе, нанесенной на колонку.

Пробы крови в объеме 9 мл отбирали в центрифужные пробирки, содержащие 1 мл 3 % Ка2ЭДТА, 0,9 % NaCl и 500 нг аба-мектина. Полученные образцы центрифугировали 15 мин при 2000 об/мин. Затем 1 мл плазмы помещали в центрифужную пробирку, добавляли 2 мл метанола, тщательно перемешивали на Vortex и центрифугировали 30 мин при 6000 об/мин. Супернатант фильтровали через мембранный фильтр (размер пор 0,45 мкм) типа «Свиннекс» и наносили на патрон для твердофазной экстракции Chromabond С8 100 mg, предварительно промытый 1 мл метанола. Промывка патрона и нанесение образцов осуществляли самотеком. Раствор после патрона отбрасывали. Патрон сушили азотом 2 мин при 5 атм. и промывали 1 мл метилтретбутилового эфира. Элюат собирали в пробирку с притертой пробкой. В элюат добавляли 50 мкл 1-метил-имидазола, перемешивали, вносили 50 мкл трифторуксусного ангидрида, перемешивали еще раз и отстаивали до образования маслообразного осадка и просветления надосадочного слоя. Из надосадочного слоя осторожно отбирали 100 мкл раствора и переносили в пробирку с притертой пробкой, содержащую 1 см3 ацетонитрила. После проведения всех вышеперечисленных процедур образец готов для ВЭЖХ анализа.

В качестве стандартных растворов используют шесть образцов крови с известными концентрациями ивермектина и абамектина. Для этого в центрифужных пробирках готовят шесть водных растворов объемом 1 мл, содержащих 3 % Ма2ЭДТА, 0,9 % NaCl, ивермектин (0, 10, 50, 100, 500, 1000 нг, соответственно) и абамектин 500 нг. pH растворов доводят до 7,4 раствором NaOH. Ивермектин и абамектин добавляют в виде аликвот ацетонитрильных растворов. Конечное содержание ацетонитрила не должно превышать 0,1 % для предотвращения гемолиза крови.

В пробирки с приготовленными растворами отбирали по 9 мл крови, получая шесть стандартных образцов крови с концентрациями ивермектина 0, 1,5, 10, 50, 100 и абамектина 50 нг/мл. Дальнейшую подготовку проб проводили аналогично образцам крови.

Хроматографический анализ проводили на ВЭЖХ системе «Стайер», состоящей из ВЭЖХ насоса серии 2, флуориметриче-ского детектора модели 121, колонки Luna С 18(2) 5 цш 150×2,0 mm. Подвижная фаза — ацетонитрил: метанол -5:4, скорость потока 300 мкл/мин. Объем инжектируемой пробы 20 мкл. Детектирование вели по интенсивности флуоресценции производных ивермектина и абамектина (компоненты BJa) при длинах волн возбуждения и эмиссии 365 и 470 нм соответственно.

Для получения достоверных результатов проверяют линейность калибровочной кривой, построенной по отношению площадей хроматографических пиков ивермектина и абамектина (компоненты Bia) от концентрации ивермектина.

Строят кривую зависимости коэффициента аппроксимации kот содержания ивермектина в стандартном образце крови. Для этого kj рассчитывают по формуле

S4cm — площадь хроматографического пика абамектина в стандартном образце крови; C1cm — содержание ивермектина в стандартном образце крови, нг/мл; S1cm — площадь хроматографического пика ивермек-тина в стандартном образце крови.

Полученную зависимость аппроксимировали (достоверность аппроксимации R2>0,98) по уравнению

где a, b — эмпирически подобранные константы; C1cm — концентрация ивермектина в стандартном образце крови, нг/мл.

Средний коэффициент kf рассчитывают по формуле

где kji — коэффициент, соответствующий i-му стандартному образцу крови; п — количество стандартных образцов крови, содержащих ивермектин.

Содержание ивермектина (нг/мл) в исследуемом образце крови находят по формуле

где S1обр — площадь хроматографического пика ивермектина в исследуемом образце крови; S4обр — площадь хроматографического пика абамек-тина в исследуемом образце крови; а, b — эмпирические константы, вычисленные ранее; kf — средний коэффициент, вычисленный ранее; 0,9 -коэффициент разведения.

Метод определения содержания ивермектина в молоке аналогичен методу определения содержания его в крови, за исключением того, что антикоагулянт (Ъ^ЭДТА) не применяют и пробы молока не центрифугируют.

6.3. Пиперазины

Несмотря на широкое применение в ветеринарии и медицине солей пиперазина методы анализа их в продуктах животноводства разработаны недостаточно. Методы титрации не обладают высокой чувствительностью и избирательностью определения, поэтому их не используют на практике.

Пиперазин гексагидрат поглощает неспецифичной коротковолновой части УФ-спектра, что препятствует его определению с помощью спектрофотометрических методов анализа, жидкостной хроматографии с УФ-детектором и тонкослойной хроматографии с хроматоскопическим определением положения пятен на пластинке. Известны методы анализа пиперазина методом газожидкостной хроматографии в виде нитрозаминов (В.A. Dawson, R.C. Lawrence, 1987) или ацетилированных производных (N. Fresenius, 1988).

И.Е. Шумакович в 1993 г. (отчет ВИГИСа, неопубл.) определяла микроколичества пиперазина гексагидрата в пробах животного происхождения методом реакционной газожидкостной хроматографии с извлечением препарата из проб изопропиловым спиртом и очистки экстракта перераспределением в системе аце-тонитрил-гексан. Нижний предел определения — 0,5 мг/кг. Степень определения — 80±5,0 %.

Реактивы и растворы. Изопропиловый спирт х.ч.; ацетонитрил х.ч.; гексан х.ч.; метанол х.ч.; пиридин ч.д.а.; уксусный ангидрид х.ч.; смесь для ацетилирования (уксусный ангидрид и пиридин) в соотношении 3 : 2; натрий сернокислый безводный ч.д.а.; стандартный раствор пиперазина гексагидрата безводный ч.д.а.

Приборы и посуда. Хроматограф «Chrom-5» с плазменноионизационным детектором; хроматографическая колонка стеклянная длиной 3 м и внутренним диаметром 3 мм; весы аналитические; гомогенизатор; прибор для встряхивания; вакуумный ротационный испаритель; насос водоструйный; колба коническая на 100 мл; воронки химические; фильтры бумажные; колбы круглодонные со шлифами на 50 и 100 мл; воронки делительные на 250 мл; цилиндры на 100 мл; пипетки на 0,2 и 2 мл; микрошприц на 10 мкл.

Ход анализа. Экстракция и очистка экстракта. Анализируемую пробу животной ткани (мышцы, печень, легкие, сердце и др.) массой 5-10 г (точная навеска) гомогенизируют и помещают в коническую колбу на 100 мл, заливают 20 мл изопропилового спирта и экстрагируют при постоянном встряхивании в течение 60 мин. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр в коническую колбу на 100 мл, а пробу повторно заливают 20 мл изопропилового спирта и экстрагируют при постоянном встряхивании в течение 30 мин. Экстракты объединяют в круглодонной колбе.

Экстракт упаривают досуха на ротационном испарителе. Остаток последовательно растворяют в 20 мл ацетонитрила и 20 мл гексана и количественно переносят в делительную воронку. После осторожного перемешивания слоям дают разделиться. Верхний гексановый слой отбрасывают. Переэкстракцию с гексаном повторяют дважды. Ацетонитрильный слой переносят через бумажный фильтр с безводным сернокислым натрием в круглодонную колбу на 50 мл и упаривают досуха в вакууме при температуре не выше 40 °C. Сухой остаток ацетилируют, для чего колбу обмывают 0,2 мл метанола и 0,2 мл смеси уксусного ангидрида: пиримидина (3 : 2) и выдерживают 30 мин при температуре 60-70 °C. Продукт реакции упаривают досуха на ротарном испарителе при температуре 70-80 °C и растворяют в 0,2 мл метанола. Аналогично ацетилируют 0,2 мл стандартного раствора пиперазина гексагидрата.

Условия хроматографирования: газожидкостной хроматограф типа «Chrom-5» с плазменно-ионизационным детектором; стеклянная колонка длиной 3 м и внутренним диаметром 3 мм; сорбент (0,125-0,15) с нанесенной неподвижной фазой ХЕ-60 (5 % от массы носителя); скорость подачи азота 40 мл/мин.; температура инжектора 245, термостата 210, детектора 250 °C; объем вводимой в хроматограф пробы 2-10 мин; скорость протяжения ленты самописца 0,15 см/мин; время удерживания ацетилированного производного пиперазина 7 мин.

Обработка результатов анализа. Количественное определение пиперазина гексагидрата проводят по его ацетилированному производному. Содержание пиперазина гексагидрата в пробе (X, мг/кг или мкг/г) рассчитывают по формуле

где H1,Н2 — высота пика анализируемого производного пиперазина в стандарте и пробе, мм; С — содержание препарата в стандартном растворе, введенном в хроматограф, мкг; V — объем конечного раствора, из которого отбирают аликвоту для хроматографирования, мкл (200-500 мкл); V1- объем аликвоты, вводимой в хроматограф, мкл (2-10 мкл); Р — масса анализируемой пробы, г.

6.4. Пиримидины

Определение остаточных количеств пирантел тартрата в органах и тканях овец, леченных пирителом, проводили методом тонкослойной хроматографии, стандартизированным R. Gauch et al. (1983), Т.С. Новик, Н.Н. Савченко (1986) для изучения фармакокинетики пирантел тартрата в организме животных.

Изучение сроков выведения пирантел тартрата из организма овец провели на 18 цигайских валухах в возрасте 10-12 мес, спонтанно инвазированных стронгилятами пищеварительного тракта. Пирител фирмы «ЛЕК» (Словения) задавали овцам индивидуально перорально однократно в рекомендованной фирмой терапевтической дозе 25 мг/кг по ДВ из расчета 2 г 12,5%-ного порошка на 10 кг массы тела. Двум контрольным валухам препарат не назначали. Животных по 3 головы убивали через 1, 3, 5, 7, 10 и 14 сут после введения препарата. Для исследований на содержание пирантел тартрата после убоя овец брали кусочки печени, почек, мышечной и жировой ткани (околопочечной), легких, а также кровь, желчь и фекалии. До исследования пробы органов и тканей хранили в холодильнике при температуре — 20 °C.

Принцип метода основан на экстракции пирантел тартрата из тканей 0,1 Н раствором соляной кислоты, обезжириванием экстракта путем вымораживания на холоде, очистке экстракта рядом перераспределений между различными растворителями и хроматографирование в тонком слое силикагеля на пластинках «Силу-фол».

Определяемость метода 85%, чувствительность — 0,05 мг/кг.

Растворители и реактивы: ацетон х.ч.; натрий сернокислый безводный; 0,1 Н HCL; хлористый натрий; этиловый эфир; гексан; 1%-ный раствор FeCl3; ацетонитрил; стандартный раствор пирантел тартрата (42,8 мг в 1 л метанола).

Приборы и посуда: камеры для хроматографирования; аппарат для выпаривания растворов; пластинки для хроматографирования «Силуфол»; весы аналитические; делительные воронки на 50 мл; химические мерные цилиндры на 100 мл; конические колбы с притертой пробкой на 250 мл; плоскодонные колбы на 250 и 40 мл; микропипетки на 100 и 200 мкл; водяная баня; аппарат для встряхиванияя; ротационный аппарат.

Ход анализа: измельченную ткань животного происхождения (навеска 10-20 г) помещают в колбу на 250 мл, добавляют 1 мл 0,1 Н HCL и 30 мл ацетона и помещают при периодическом помешивании при 40-50 °C в водяную баню на 30 мин. Экстракт декантируют через бумажный фильтр, помещая в колбу на 250 мл и обезжиривают путем вымораживания. Переэкстракцию проводят путем добавления 0,1 Н HCL, 0,25%-ного раствора хлористого натрия, этилацетата. Верхнюю фазу органического растворителя отделяют, предварительно освободившись от водной фазы путем добавления 5 мл этилацетата (пирантел тартрат переходит в этилацетат). Далее проводят хроматографирование в условиях двух-143 мерной тонкослойной хроматографии. Первая система — эфир : гексан, вторая — ацетон : гексан. Окрашивают хроматограмму FeCl3 и помещают на 15 мин в сушильный шкаф при 60 °C для выявления пятен фиолетового цвета.

Количественное определение пирантел тартрата проводят путем измерения площадей и измерения количества препарата (мкг) по калибровочному графику, предварительно построенного, исходя из заведомо известных концентраций препарата. Кроме того, определение пирантел тартрата возможно путем сравнения площадей пятен пробы и стандарта.

Содержание пирантел тартрата в анализируемых пробах (X, мг/кг) рассчитывают по формуле

где А — содержание пирантел тартрата в стандартном растворе, мкг; В -масса анализируемой пробы, г; 1 — площадь пятна стандартного раствора, мм; 2 — площадь пятна пробы, мм.

6.5. Хлорированные углеводороды

Для исследований брали кусочки печени, сердца, крови, молока и почек массой по 10 г в разные сроки после дачи антитрема в дозе 0,2 г/кг. Затем пробы измельчали, помещали в плоскодонную колбу емкостью 50 см3, добавляют 30 см3 ацетона и экстрагируют препарат 1,5-2 ч при комнатной температуре при периодическом встряхивании, далее колбу с экстрактом оставляют на 24 ч при температуре 2-4 °C. По окончании раствор декантируют через бумажный фильтр в делительную воронку емкостью 250 см . Колбу споласкивают ацетоном. К экстракту добавляют 150 см3 25%-ного хлористого натрия и 30 см3 гексана, тщательно перемешивают содержимое в течение 5 мин. Дают слоям разделиться и переносят содержимое в другую воронку: антитрем экстрагируют гексаном (один раз 30 см3).

Гексановые экстракты выпаривают досуха, растворяют в 0,3 см3 гексана и проводят хроматографию. Экстракт наносят на хроматографическую пластинку «Силуфол» с помощью микропипетки по 0,3 см3. Хроматограмму развивают в системе гексан. После поднятия фронта растворителя на 10 см хроматограмму подсушивают и затем облучают УФ-светом до появления пятен фиолетового цвета и опрыскивают 1%-ным раствором AgNO3 и далее облучают УФ-свегом. Пятна вырезают, переносят на миллиметровую бумагу, обводят и вычисляют их площадь (Н.Н. Савченко, 1990). Нижний предел определяемое™ в пробах — 0,05 мг/кг.

6.6. Салициланилиды

Определение фенасала в мясе рыб проводят методом УФ-спектрофотометрии (И.Е. Шумакович, перс, сообщ.). На 1, 5, 10, 15, 20-е сутки после однократного применения 6%-ной кормолекарственной смеси с фенасалом в терапевтической дозе 120 мг/кг проводят отлов по пяти годовиков карпа. В эти же сроки определяют количество фенасала в воде и водорослях. В качестве контроля используют рыбу и пробы воды и водорослей, отобранные до начала опыта.

Реактивы и оборудование: ацетон ч.д.а.; этилацетат ч.д.а.; н-гексан ч.д.а.; ацетонитрил ч.д.а.; 0,1н НС1, приготовленный стандарт титра; безводный сульфат натрия; вакуумный водоструйный насос; весы аналитические; роторный испаритель; аппарат для встряхивания; УФ-спектрофотометр.

Методика определения фенасала. 10 г гомогенизированного мяса рыб (карпа), взвешенного с точностью до второго знака после запятой, помещают в стеклянный стакан вместимостью 100 мл, добавляют 1 мл 0,1 н НС1, 20 мл ацетона и экстрагируют фе-насал при встряхивании на аппарате в течение 1 ч при комнатной температуре. Экстракт фильтруют под вакуумом через воронку Бюхнера в колбу Вюрца. Остаток на фильтре промывают 10 мл ацетона. Фильтрат переносят в делительную воронку вместимостью 100-250 мл, добавляют 20 мл 0,1 н НС1, 30 мл этилацетата и осторожно встряхивают в течение 1 мин. Водную фазу экстрагируют еще два раза порциями по 20 мл этилацетата. Верхний слой органического растворителя фильтруют через безводный сульфат натрия в коническую колбу вместимостью 100 мл. Фазу органического растворителя выпаривают на роторном растворителе в круглодонной колбе до жирного остатка. Колбу обмывают 20 мл гексана и 2 раза порциями по 10 мл ацетонитрила. Оба раствора помещают в делительную воронку вместимостью 100 мл и встряхивают в течение 1 мин. Слой гексана после деления фаз отбрасывают. Ацетонитрил еще раз промывают, встряхивают с 10 мл гексана, переносят в круглодонную колбу и выпаривают досуха. Остаток на колбе обмывают 5 мл ацетона, 0,1 н НС1 и 0,1 мл моноэтанол амином. УФ-спектр полученного раствора снимают в диапазоне длин волн 340-450 мм в кюветах толщиной поглощающего слоя 1 см относительно аналогично приготовленного растворителя. Максимум или плечо в области 370-380 нм прописывают в присутствии фенасала. Чувствительность обнаружения фенасала — 10 мкг в пробе или 1 ppm. Удельный показатель поглощения фенасала в ацетоне после добавления моноэтаноламина Е = 29083. По этой методике определяется до 90 % содержащегося в пробе фенасала.

6.7. Дифенилсульфиды

Остаточные количества битионола в органах и тканях овец и кроликов были изучены радиоактивным методом (Л. Василяу-скас, 1969; А.Й. Вишняускас и др», 1978). Битионол сульфоксид в дозе 40 мг/кг выводится из организма через 95 ч в основном целой молекулой (J.C. Gederain et al., 1969). Кроме того, в ВИГИСе ранее был разработан метод тонкослойной хроматографии для определения остаточных количеств битионола после лечения платенолом (Л.А. Лаптева, М.Б. Мусаев, 1996). Учитывая сложность радиоактивного метода авторами подобран как более при-емлимый и чувствительный для данного препарата метод тонкослойной хроматографии.

Для исследования на содержание сульфоксида битионола после убоя животных, спонтанно инвазированных стронгилятами пищеварительного тракта и дегельминтизированных левацидом в терапевтической дозе, берут кусочки печени, сердца, почек, мышц, жира, легких, а также кровь, желчь и фекалии. До исследования пробы органов и тканей хранят в холодильнике при температуре — 20 °C.

Принцип метода основан на извлечении сульфоксида битионола из анализируемых проб ацетоном с добавлением 5 капель 0,1 Н уксусной кислоты, очистке полученного экстракта в системе ацетонитрил-гексан, хроматографировании в тонком слое силикагеля на пластинках «Силуфол», идентификации пятна на пластинке проявляющим реактивом (1%-ным раствором хлорного железа) и определении сульфоксида битионола. Чувствительность метода 0,05 мг/кг; определяемость 80,0+5,0 %.

Реактивы: ацетон; натрий сернокислый безводный; этиловый эфир уксусной кислоты; ацетонитрил; стандартный титр 0,1 Н раствора СНзСООН; 1%-ный раствор хлорного железа в дистиллированной воде.

Оборудование: аппарат для встряхивания; ротационный аппарат; весы аналитические; делительные воронки на 250 мл; химические мерные воронки на 50 мл; колбы конические с притертой пробкой на 250 мл; химические мерные цилиндры на 100 мл; плоскодонные колбы со шлифтом на 10 и 150 мл; пипетки на 0,1; 0,2 и 0,5мл; камеры для тонкослойной хроматографии.

Ход определения: измельченные пробы органов и тканей животных массой 10 г помещают в плоскодонную колбу на 100 мл, вносят 5 капель 0,1 Н СНзСООН, при постоянном встряхивании добавляют 50 мл ацетона и экстрагируют 1,5 ч. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр в круглодонную колбу объемом 250 мл, к фильтрату добавляют 30 мл ацетона и повторно экстрагируют 30 мин, затем экстракты объединяют в круглодонной колбе. Объединенные экстракты упаривают в ротационном аппарате до 0,5 мл, добавляют 30 мл ацетонитрила и переносят в делительную воронку на 250 мл. Туда же добавляют 30 мл гексана и осторожно встряхивают в течение 2 мин. После разделения слоев нижний ацетонитрильный слой переносят в круглодонную колбу через бумажный фильтр, заполненный на 2/3 сернокислым безводным натрием и упаривают содержимое до объема 0,3-0,4 мл.

Хроматографирование. На пластинку «Силуфол», предварительно выдержанную в сушильном шкафу при температуре 120 °C в течение 20 мин, наносят 0,3 мл экстракта пипеткой на 0,1-0,4 мл. Остаток экстракта из пипетки смывают ацетонитрилом и также наносят на пластинку так, чтобы диаметр пятна не превышал 1 см. Пластинку помещают в хроматографическую камеру № 1 со смесью эфиргэтанол (1:1). Когда фронт растворителя поднимается до верхнего края пластинки, ее вынимают и высушивают на воздухе. После высыхания на нее параллельно с опытным пятном наносят стандартный раствор битионола в ацетонитриле и помещают в хроматографическую камеру № 2 со смесью этилаце-тат:гексан (2 : 1). После поднятия фронта растворителя до 10 см, пластинку вынимают из камеры и высушивают на воздухе. Зоны локализации битионола обнаруживают после опрыскивания хроматограммы раствором FeCl3 в виде пятна фиолетового цвета.

Обработка результатов. Количество сульфоксида битионола в пробе определяют по формуле (2).

Название книги — Антигельминтики фармакология и применение

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *