Занятие 11-13 группы крови и биохимический полиморфизм белков

ТЕМА 5

ЗАНЯТИЕ 11

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГРУПП КРОВИ
У СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ И ПТИЦЫ

Цель занятия. Ознакомиться с методами постановки реакций гемолиза и агг­лютинации при определении групп крови.

Материалы и оборудование. Кровь для исследования, антикоагулянт, центри­фуга, пробирки, физиологический раствор, термостат, микроскоп.

Содержание занятия. Антигены расположены на поверхности эритроцитов, некоторые из них могут быть в плазме крови, слю­не и других биологических жидкостях. Эритроцитарных антиге­нов довольно много. У крупного рогатого скота известно свыше 100 антигенов, у кур — 60, у свиней — 40. Эти цифры характеризу­ют не столько абсолютное число антигенов, сколько степень их изученности у разных видов животных. Антигены обозначают буквами латинского алфавита. В связи с тем что число выявлен­ных антигенов превышает число букв в алфавите, к буквам по мере выявления новых антигенов стали приписывать или штрихи справа сверху — А’, В’, С’, или цифры внизу — А1, А2 и т. д. Одна­ко сходство антигенов по буквам не свидетельствует об их генети­ческой близости.

Отдельные антигены встречаются обычно в виде различных, но постоянных сочетаний. Например, антиген F у крупного рогатого скота сочетается с антигеном V, а антиген А у человека — с антиге­ном В. Исходя из этого, было сделано заключение, что антигены F и V контролируются разными аллелями одного локуса и составля­ют одну генетическую систему FV. В этой системе может быть три сочетания: FF, FV и VV. В системе АВО у человека антигены А и В могут встречаться вместе, но могут быть и отдельно. Сочетания антигенов в пределах генетической системы получили название групп крови. У различных животных число антигенных факторов может быть разным, и они могут быть в самых различных сочета­ниях. При 100 антигенных факторах у крупного рогатого скота может быть миллиард различных сочетаний. В связи с этим набор антигенных факторов у отдельных животных (тип крови) так же индивидуален, как и отпечатки пальцев у человека.

Системы групп крови обозначают обычно заглавной буквой ла­тинского алфавита, например система В; аллели — буквой систе­мы с надстрочным индексом, например Ва, Вь, а обусловливаемые ими антигены — двумя буквами — большой и малой, например Ва и ВЬ. Генотипы особей согласно законам генетики включают по два аллеля, которые разделяются наклонной чертой, например В аа или В аь. Фенотипы обозначают буквой системы, за кото­рой в скобках перечислены антигены данной системы со знаками «+» и «-». Знак «плюс» означает наличие, а знак «минус» — отсут­ствие данного антигена, например фенотип В (а + Ь —) свидетель­ствует о том, что у особи есть антиген Ва, но отсутствует антиген ВЬ. Фенотип В (а + Ь —) сокращенно обозначают Ва, а фенотип В (а + Ь +) — ВаЬ. Для определения групп крови используют реакции гемолиза и агглютинации. Постановка реакции гемолиза. 10 мл крови поме­щают в пробирку с консервантом (антикоагулянтом) в соотно­шении 1 : 5. Группы крови определяют гемолитическими теста­ми с помощью реагентов (моноспецифической сыворотки), унифицированных в международных испытаниях.

Для отделения эритроцитов от плазмы кровь в течение 10 мин центрифугируют при частоте вращения 1500 мин-1, после чего отсасывают из пробирки надосадочную жидкость. В пробирки доливают физиологический раствор и содержимое вновь цент­рифугируют. Отмывание эритроцитов от плазмы повторяют трижды. Из тщательно отмытых эритроцитов готовят 2,5%-ную суспензию, отмеряя градуированной пипеткой 0,25 мл отмытых эритроцитов, добавляя к ним 9,75 мг физиологического раст­вора.

Суспензия служит эталоном, по цвету которого готовят суспен­зии эритроцитов всех других животных, подлежащих аттестации.

В лунки из полиэтиленовых блоков или в иммунологические пробирки стандартной пипеткой (или пастеровской) разносят по две капли реагента, затем прибавляют одну каплю (0,05 мл) 2,5%-ной суспензии эритроцитов исследуемого животного. Смесь тщательно перемешивают и оставляют на 15 мин в покое при комнатной температуре. Затем добавляют по одной капле комплемента* .

* Комплемент (алексин) — сложное вещество, действующее подобно ферменту. Вследствие действия комплемента наступает разрыв эритроцитов, ускоряется ре­акция гемолиза. В качестве комплемента используют сыворотку крови морской свинки или кролика.

Смесь встряхивают и оставляют еще на 30 мин и тщательно пе­ремешивают, после чего инкубируют в течение 2—2,5 ч при температуре 28—30 °С. После этого проводят первую читку реакции и после встряхивания смеси вновь ставят в термостат на 3,5 ч при той же температуре.

При наличии в эритроцитах антигена в сыворотке наступает ге­молиз: оболочки эритроцитов разрываются, а гемоглобин, выйдя из оболочки, окрашивает жидкость в розовый цвет. Полный гемо­лиз характеризуется лаковой окраской жидкости (балл 4), частич­ный гемолиз оценивают баллами 3, 2, 1, отсутствие реакции — ну­лем.

При отсутствии реакции эритроциты оседают на дно, среда ос­тается неокрашенной.

Постановка реакции агглютинации. В каждую пробирку (лунку) ряда штатива (пластины) вносят по две капли агглютинирующей сыворотки и одну каплю 2,5%-ной суспензии эритроцитов. В последний ряд (контрольный) вносят по две капли физиологического раствора и одну каплю суспензии.

При работе с эритроцитами свиней через 1 ч инкубирования содержимое лунок встряхивают, а спустя 1 ч после встряхивания проводят читку реакции.

При работе с эритроцитами овец читку проводят два раза спус­тя 30 мин и 2 ч с момента поставки реакции.

При работе с эритроцитами лошадей читку реакции осуществ­ляют через 3 ч.

Реакцию читают визуально с помощью вогнутого зеркала. Вы­раженность реакции регистрируют по 4-балльной системе:

0 (или точка) — эритроциты свободно взвешены, жидкость красная (реакция отсутствует);

1 балл — агглютинация эритроцитов слабо заметна, жидкость мутная;

2 балла — эритроциты в виде мелких комочков, жидкость мут­ная;

3 балла — эритроциты соединены в комочки разной величины, жидкость слегка мутная;

4 балла — эритроциты соединены в один комок, жидкость про­зрачная.

Реакцию читают перед источником рассеянного света (свет, проникающий через матовое стекло) или в отраженном свете от вогнутого зеркала.

Определение групп крови у крупного рогато­го скота реакцией гемолиза. У крупного рогатого скота в настоящее время выявлено 12 систем групп крови: А, В, С, F—V, J, L, M, N’, Т, S, Z, R’—S’, которые контролируют синтез более 100 антигенов (табл. 15).

Система А включает в себя восемь антигенов. Система В (наи­более сложная) включает более 30 антигенов, в различных комби­нациях образует более 500 аллелей. Около 10 антигенов системы В наследуются единым комплексом, например BBGK, BBG, BBGK02I1A и др. В системе С более 10 антигенов. Разработана линейная мо­дель сублокусов, контролирующих группы крови этой системы. Система J — группы крови дифференцируется на Jcs, Js, Ja. Jcs — антиген, имеющийся в эритроцитах и плазме; Js — антиген, имею­щийся только в плазме; Ja — отсутствие антигена как в эритроци­тах, так и в плазме. Система F—V состоит из двух антигенов с под­типами F1, F2 и V1, V2, V3. Система L, представленная одним ан­тигеном, имеет два фенотипа (L+ и L) и три генотипа (L/L, L/1 и 1/1). Система М контролирует четыре антигена (М1, М2, М’ и m). Система S представлена семью антигенами и шестью подтипами. Системы L, Т’, N’, имеющие по одному антигену, называются простыми, а системы, имеющие от двух и более антигенов, — сложными. Деление это условное, так как, возможно, будут от­крыты новые антигены. Сложные В-, С- и S-локусы групп крови у крупного рогатого скота являются примером ступенчатого аллелизма у высших животных.

 

Задание 1. По группам крови быков черно-пестрой породы (табл. 16, рис. 37) определите и запишите результаты иммунологи­ческих реакций, если использовались следующие реагенты: A1, A2, Z’; Bi, B2, Gi, G2, G3, Ii, I2, K, Oi, O2, O3, Ox, Pi, P2, Q, Ti, T2, Yb Y2, A’i, A’2, B’, E’i, E’2, E’3, D’, G’, F’, I’, J’2, K’, O’, P’i, Q’, Y’, B», G»; Ci C2, E,  Ri,  R2, Xi, X2,  C’, L’; F, V; J; L; M; Si,  S2, H’,  U, U’, H», U»; Z.

Определение групп крови у овец. Группы крови овец менее изучены, чем группы крови других животных. К насто­ящему времени выявлено i6 генетических систем (А, В, С, D, J, M, R, X—Z, Con, F30, F4, Hel, Y, T, V, PV), контролирующих 39 антигенов (табл. 17). У коз идентифицированы пять систем групп крови (B, C, M, R, F30).


Определение групп крови у кур методом пря­мой агглютинации. У кур в настоящее время открыто 14 си­стем (А, В, С, D, E, H, J, Y, К, Z, N, P, R, Vh), контролирующих 95 антигенов, включающих по два и более аллеля (табл. 18). Наи­более сложная система В включает 35 антигенов. При обозначе­нии аллелей к заглавной букве, обозначающей генетическую си­стему, прибавляют надстрочную цифру (В418 и т. д.). Соответству­ющие антигены обозначают В4, B18.


Первая номенклатура для групп крови кур предложена Брайл- сом с соавторами. Каждый антиген они обозначали символом В12, В3 и т. д. Установлено, что антигены А и В систем групп крови у кур представляют собой серологически сложные комплексы, со­стоящие из многих антигенных детерминант. Каждый антигенный комплекс наследуется как самостоятельная единица, не имеющая себе подобных в других популяциях.

Это создало определенные трудности при унификации групп крови у кур.

Кровь у кур берут из подкрыловой вены. Используют те же консерванты, что и для крови крупного рогатого скота.

Определение групп крови у свиней. У свиней вы­явлено 17 генетических систем групп крови (А, В, С, D, Е, F, G, H, I, J, К, L, M, N, О, Р, Q), контролирующих 83 эритроцитар­ных антигена (табл. 19). Наиболее сложные системы Е (16 антиге­нов), L (13 антигенов) и М (11 антигенов). Остальные системы со­держат 2—6 антигенов.

Антигены во всех системах обозначают заглавной буквой с бук­венными индексами, например, Fa, Fb, Fc, Fd или Ba, Bb; геноти­пы — Ваа, Bb/Bb, Ваь; фенотипы — В (а + b —) или Ва; В (а — b +) или Bb (а + b + ) или Bab.


В таблице 20 приведены три генетические системы групп крови свиней. Система F двухаллельная. С аллелем Fа связан антиген Fа. Антиген, обусловленный аллелем F, существующими иммуноло­гическими реагентами не обнаруживают. Наследование происхо­дит по типу полного доминирования аллеля Fа над F. Поэтому трем возможным генотипам соответствуют лишь два фенотипа, так как гомозиготы Fa/Fa и гетерозиготы Fa/F фенотипически по­добны друг другу — F(a+).

Система В также двухаллельная с кодоминированием аллелей Ва и Вь. Аллели Ва и Вь обусловливают образование специфиче­ских антигенов Во и Вь. Благодаря кодоминированию трем воз­можным генотипам соответствуют три разных фенотипа (три группы крови) — В (а + b —), В (а — b +) и В (а + b +).

Система Е сложная. Она состоит из семи аллелей и семи анти­генов. В отличие от аллелей предыдущих систем каждый аллель системы Е вызывает образование не одного антигена, а целого комплекса их. Так, с аллелем Eaeg связаны три антигена — Еа, Ее и Eg. При генотипе Eaeg/Eedfh эритроциты содержат шесть антигенов — Еа, Ed, Ее, Eg, Ef и Eh. Фенотипы в данном случае представляют обычно в форме таблицы, в которой наличие или отсутствие анти­генов обозначают знаком «плюс» или «минус».

Кровь у свиней берут из передней полой вены или из сосудов кончика хвоста. Для определения групп крови используют реак­цию агглютинации. Однако не все антигены крови свиней можно выявить этим методом. Второй этап — выявление (фиксация) при помощи антиглобулиновой сыворотки неполных агглютининов на поверхности эритроцитов (проба Кумбса). Эритроциты трижды от­мывают физиологическим раствором и готовят из них 1%-ную су­спензию. Суспензию разносят по одной капле в пробирки, добав­ляют по одной капле антиглобулиновой сыворотки. Смесь тщатель­но перемешивают встряхиванием и оставляют на 15 мин, после чего наливают в пробирки и центрифугируют при частоте вращения 1000—1500 мин-1 в течение 2—3 мин. После центрифугирования пробирки расставляют в штативы, оценивают результаты реакции по 5-балльной системе: минус — отсутствие реакции, четыре плю­са — наиболее сильная реакция, когда все эритроциты склеивают­ся в комочки.

Задание 2. Определите и запишите системы групп крови у жи­вотных по данным иммуногенетических исследований (табл. 21).


Задание 3. По данным таблицы 19 составьте и запишите воз­можные генотипы свиней.

Определение групп крови у лошадей. Группы кро­ви у лошадей включают более девяти систем (А, С, D, К, Р, Q, Fc, T, U, So), контролирующих 20 антигенных факторов (табл. 22). Системы С, К, U и Fc включают по два аллеля, остальные — более двух. Система Р групп крови аналогична системе АВО человека. Наиболее сложной является система D, включающая 13 антиге­нов, которые образуют более 30 феногрупп.

Современное обозначение антигенов в системах групп крови лошадей дают с обозначением систем групп крови с буквенными индексами, например в системе D антигены Da, Dc, Dd, De, Df, Dg (табл. 22).

Задание 4. По данным таблицы 23 определите и запишите сис­темы групп крови обследованных лошадей.

ИЗУЧЕНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА БЕЛКОВ С ПОМОЩЬЮ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
ЗАНЯТИЕ 12

Цель занятия. Изучить методы электрофореза, используемые для разделения на фракции белков и ферментов. Освоить методики расшифровки фореграмм.

Материалы и оборудование. Кровь для исследования, буферный раствор, элек­тролит, краситель, хроматограф, фильтровальная хроматографическая бумага, ме­танол, ледяная уксусная кислота, дистиллированная вода, 20%-ный раствор тео- мерсаля, пробы молока, центрифуга, пипетки, пробирки.

Содержание занятия. Методом электрофореза в крахмальном и полиакриламидном гелях открыты генетические варианты многих белков и ферментов: в сыворотке крови, молоке и других жидко­стях организма (рис. 38, 39). Электрофоретические варианты на­следуются кодоминантно, что позволяет их использовать в каче­стве генетических маркеров.

Крахмальный гель в виде пластинок, в которых проводится электрофорез трансферрина, казеина, ферментов и других белков, готовят из гидролизованного крахмала. Полиакриламидный гель обладает повышенной разрешающей способностью, благодаря чему можно определить большое число фракций тестируемых белков.


Изучение типов трансферрина. Трансферрин — это белок крови, который переводит железо плазмы в диионизирован­ную форму и переносит его в костный мозг, где оно используется для кроветворения. Он является наиболее изученной фракцией железосвязывающих р-глобулинов сыворотки крови. Установле­но, что основные его типы контролируются тремя аутосомными генами TfA, Tf°, Tf® одного локуса, определяющими шесть воз­можных фенотипов: АА, DD, EE, AD, AE, DE.

Кровь для исследования в количестве 15—20 мл берут из ярем­ной вены и помещают в стерильные пробирки. Для получения сыворотки кровь инкубируют в течение 3—5 ч при температуре 35—36 °С. После образования сгустка эритроцитов сыворотку сли­вают в другую пробирку и центрифугируют. Очищенную от эрит­роцитов сыворотку сливают во флаконы вместимостью 5—10 мл. Образцы сыворотки хранят при температуре 4 °С. Для длительного хранения (до 6 мес) сыворотку замораживают и хранят в моро­зильной камере холодильника.

Приготовление рабочих растворов (буферный раствор для геля, электролит, краситель). Для буферного раствора готовят раствор А из 10,5 г лимонной кислоты и дистиллированной воды до 1 л и ра­створ В из 23 г триса (трисоксиметиламинометана) и дистиллиро­ванной воды до 1 л. При приготовлении электролита 18,55 г борной кислоты и 4,0 г едкого натра насыпают в колбу вместимостью 1 л и добавляют дистиллированной воды до 1 л при рН раствора 8,6.

Приготовление красителя. Для окрашивания белков в крахмаль­ном геле используют 1%-ный раствор амидочерного 10 В. 1 г ами­дочерного красителя растворяют в 100 мл жидкости, состоящей из этилового спирта, дистиллированной воды и ледяной уксусной кислоты в соотношении 5 : 5 : 1. В этой жидкости проводят также обесцвечивание окрашенных пластинок геля (фореграмм).

Гель готовят из 13%-ной концентрации гидролизованного крахмала. В колбу вместимостью 1 л насыпают 28 г гидролизован­ного крахмала и наливают 210 мл буферного раствора. Смесь раз­мешивают до образования равномерной суспензии и нагревают на пламени горелки при постоянном взбалтывании. Нагревание про­должают до образования тягучей светлой однородной массы. Пу­зырьки воздуха в геле убирают с помощью вакуума. Горячую массу выливают в лоток и прикрывают стеклом. Через 40—60 мин гель застывает и гелевый блок готов для дальнейшей работы.

Проведение электрофореза. В геле на расстоянии 3 см от края лотка гребенкой делают прорези длиной 0,5—0,6 см и глубиной 0,6—0,7 см. Надавливая пальцем рядом с прорезью в геле, раздви­гают ее края и пинцетом вставляют в прорезь кусочки хроматогра­фической бумаги размером 0,5—0,7 см, пропитанной сывороткой крови.

После внесения каждого образца пинцет тщательно вытирают. Для избежания высыхания гель накрывают сверху полиэтилено­вой пленкой. Инвентарные номера животных записывают в том порядке, в каком были внесены образцы их сыворотки. Лоток ставят на электродные камеры, затем наливают электролит, кладут два слоя полоски фильтровальной бумаги (5 х 25 см) на перегородки, соединяют электролит и гель 2—3 слоями полосок фильтровальной бумаги и опускают электроды в электролит. На гель ставят лоток со льдом. Провод от электрода, на стороне кото­рого расположены образцы сыворотки, соединяют с катодной (—), а другой провод — с анодной (+) клеммой УИП-1. Затем включа­ют ток и устанавливают напряжение 300 В и силу тока 45—50 мА. Электрофорез длится 2,5 ч. В течение этого времени следят за на­пряжением и силой тока. Сила тока постоянно должна составлять 12 мА, напряжение — не более 400 В.

Ток отключают и снимают лоток с гелем. В левом углу геля скальпелем делают разрез, который будет означать начало внесе­ния проб. Лоток переворачивают вверх дном на пластинку с бор­тиками высотой 0,3 см для резки геля. Пластинки крахмального геля, на которых произведен электрофорез, называют фореграм- мами.

Для окраски фореграмм на трансферрин готовят раствор (5 ча­стей метанола, 1 часть ледяной уксусной кислоты, 5 частей дис­тиллированной воды), который насыщают амидочерным красите­лем. Для окрашивания гель разрезают продольно на половинки, которые помещают в раствор красителя на 15 мин, после чего ра­створ сливают и заменяют его жидкостью для обесцвечивания. Жидкость меняют несколько раз до полного обесцвечивания фо­реграмм. Хранить фореграммы в этой жидкости можно достаточ­но долго.

Чтение фореграмм. После окрашивания фореграмм идентифи­цируют аллели трансферринового локуса (Tf). Из 10 известных ти­пов трансферрина крупного рогатого скота наиболее распростране­ны аллели TfA, Tf®, TfE, образующие гомозиготные генотипы TfA/TfA, TfD/TfD, TfE/TfE и гетерозиготные генотипы TfA/TfD, TfA/TfE, TfD/TfE. Зоны A, D, E располагаются от катода к аноду по убывающей скорости движения в геле. Гомозиготные аллели дают три зоны, а гетерозиготные — 4—5 зон (рис. 40—42).

Задание 1. Для выяснения жизнеспособности гетерозигот по трансферриновому локусу в сравнении с гомозиготами и опре­деления лучшей сочетаемости при оплодотворении гомозигот­ных по трансферрину коров щвицкой породы составлен подбор пар для спаривания по типу «подобных гомозигот» АА х АА, DD х DD и по типу «неподобных гомозигот» АА х DD. В первом случае ожидали полностью гомозиготное потомство АА, DD, во втором — гетерозиготное потомство АD. Данные эксперимента по подбору пар швицкой породы приведены в таблице 24.


Проведите сравнительный анализ экспериментальных групп и установите достоверность различий между ними.

Задание 2. Проведен подбор родительских пар (табл. 25). Тео­ретически от такого подбора ожидали получения равного количе­ства гомо- и гетерозиготных телят по локусу Tf.

Подтверждается ли положение о меньшей эмбриональной смертности среди гетерозигот по Tf?


Задание 3. У некоторых видов сельскохозяйственных животных установлена связь воспроизводительных качеств с типами транс- феррина. Проанализируйте результаты подбора по данным таблицы 26.

Средний процент неоплодотворенных яиц в линии Р составил 17,5, в линии ЕР — 16,0.

В какой линии воспроизводительные качества выше? Каково влияние трансферринового локуса на воспроизводительные каче­ства кур? Какие вычисления нужно сделать для подтверждения полученных выводов?

Задание 4. По данным таблицы 27 определите частоту встречае­мости типов трансферрина у верховых и тяжеловозных пород и выявите возможности их использования в качестве генетических маркеров у лошадей.


Полиморфизм белков молока. Пробы молока жела­тельно брать от коров «мать-дочь». В чистые флаконы вместимо­стью 10—15 мл вносят 2-3 капли 20%-ного раствора теомерсаля (20 г теомерсаля и дистиллированной воды до 1 л) для консерви­рования молока, затем берут пробы молока от любого разового удоя коров. На флаконах должны быть наклеены индивидуальные номера животных. Молоко обезжиривают путем центрифугирова­ния. Пробы молока можно хранить при 4 °С до 10 сут. Для дли­тельного хранения флакончики с молоком помещают в морозиль­ную камеру. Внесение проб молока, электрофорез, окрашивание геля проводят так же, как и при выявлении генетических вариан­тов трансферрина, только силу тока для ускорения электрофореза белков молока повышают до 120 мА. Для этого между гелем и электролитом кладут 5—6 или более полосок фильтровальной бу­маги. Время разгонки составляет около 2,5 ч.

Основные белки, входящие в состав молока, — это казеины (Cn), лактоальбумины (La) и лактоглобулины (Lg). Лактоальбу­мины и лактоглобулины находятся в сыворотке молока. Электро­форезом в коровьем молоке выявлены следующие локусы казеи­на: aSxCn, aS2Cn, pCn, gCn, %Cn. В локусе aSxCn, составляющем 45 % всего казеина молока, выявлено четыре аллеля: aSxCnA, aSxCnB, aSxCnC, aS^nD. В локусе pCn, составляющем около 30 % всего казеина молока, выявлено шесть аллелей (A, A2, A3, BZ, С, D). Локусы %Cn и gCn имеют по два варианта: %CnA, %CnB и gCnA, gCnB. В локусе сывороточного белка aLa выявлены два аллеля (aLaA и aLaB), а в локусе pLg — четыре (bLgA, bLgB, bLgC, bLgD). Приведенные выше аллели различаются по биохимическому составу, а некоторые аллели (например, aS^nA) влияют на техно­логические особенности молока и его переваримость. Чтение фореграмм при правильном проведении электрофореза белков молока не представляет трудности (рис. 43).

При исследованиях следят за чистотой лабораторной посуды. Она должна быть тщательно вымыта от следов сывороток. Даже незначительное загрязнение пробирок и другой посуды может ис­казить результаты реакций.

Сильно загрязненные пипетки и пробирки помещают на 1—2 сут в хромовую смесь (100 г К2Сг2О7, 1 л H2SO4, 200 мл Н2О или 100 г растертого в ступке К2Сг2О7, смешивают с 3 л концентрированной серной кислоты). Затем посуду тщательно промывают и ополаски­вают дистиллированной водой.

Задание 5. Изучите электрофореграм- мы образцов молока с различными ти­пами казеинов.

Задание 6. Определите различия казеинового локуса молока коровы и лошади по электрофореграмме (рис. 44).

Задание 7. Изучите влияние введения белка обезжиренного молока в нату­ральное молоко по результатам электро­фореза (рис. 45).

ЗАНЯТИЕ 13

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДОСТОВЕРНОСТИ ПРОИСХОЖДЕНИЯ ПОТОМКОВ И АНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКОГО СХОДСТВА С РОДОНАЧАЛЬНИКОМ

Цель занятия. Освоить методики определения достоверности происхождения животных.

Материалы и оборудование. Таблицы, схемы.

Содержание занятия. Контроль за происхождением по группам крови и микросателлитам ДНК. Для ус­тановления происхождения необходимо определить системы групп крови родителей, потомков и сравнить их. Группы крови, имеющиеся у потомков, должны быть обязательно у одного или обоих его родителей.

Дополнительными тестами, повышающими точность контроля за происхождением животных, являются определения полиморф­ных типов белков и ферментов, а также микросателлитов ДНК.

В племенной работе важно установить точное происхождение животных, причем во многих случаях это можно сделать иммуно­логически — по наличию антигенов у родителей и их потомства.

Пример. Предположим, что планом воспроизводства свиней предполагалось использовать двух хряков — 297 и 543. Свиноматка 768 была покрыта одним из них, но из-за неточности записи в журнале случек возникло сомнение в проис­хождении поросят. Для установления отцовства проведен иммунологический ана­лиз поросят, матки и предполагаемых отцов. Результаты анализа приведены в таб­лице 28.

При установлении отцовства необходимо учитывать, что:

у потомства могут быть только те антигены, которые есть хотя бы у одного из родителей;

антигены, которые есть у матки, нельзя использовать для установления отца поросят, так как они могли получить их от матери;

антигены, которые есть (или которых нет) у обоих хряков, также не могут слу­жить показателями происхождения поросят;

отцовство нужно определять по антигенам, которые имеются у потомства и лишь у одного из предполагаемых отцов, но отсутствуют у матери.

В рассмотренном выше примере не могут быть использованы для определения отцовства антигены:

Еа, Ее и Fa — есть у матери;

Ее и Ef — имеются у обоих предполагаемых отцов;

Eb и Ка — нет ни у родителей, ни у потомства.

Отцовство можно установить по антигенам Аа и Gb. Поросята могли получить их только от хряка 543, чем и доказывается его отцовство.

Таким же образом, по антигенам можно установить происхождение поросят при покрытии свиноматки двумя хряками, но в отличие от приведенного примера в этом случае отцовство устанавливают для каждого поросенка отдельно.

Установить происхождение особей можно и по генотипам родителей: наличие одинаковых аллелей у матери и ее потомства не служит препятствием для установ­ления и исключения отцовства, причем анализ генотипов обеспечивает расшиф­ровку происхождения каждого потомка.

Требуется установить, какой из двух хряков является отцом поросенка. Анализ генотипов поросенка и его родителей показывает, что отцовство может быть установлено даже по одной отдельно взятой системе групп крови (из пяти приведенных выше). Например, система Е: генотип поросенка — Е^/Е^8, гено­тип его матери тот же, генотипы его предполагаемых отцов: ЕМ8е7 Еед8е7 Несмотря на то что генотип у поросенка и его матери один и тот же, это не служит препятствием к расшифровке происхождения, так как потомок может получить от матери только один из двух ее аллелей; второй же аллель поросенок получает от отца. Анализ показывает, что аллель Еае8 поросенок мог получить только от мате­ри (у предполагаемых отцов этого аллеля нет). Следовательно, второй аллель — Еед8 поросенок получил от отца. Аллель Еед8 есть только у хряка 2, значит, после­дний и является отцом поросенка. Отцовство хряка 2 можно доказать тем же спо­собом и по генотипам каждой из других систем групп коров (F, G, H и K).

Пример. Выявить вероятных отцов телят по генотипам групп крови, если ко­ровы 2906 и 7733 были осеменены дважды. В первый раз корову 2906 осеменили спермой быка 4032, а корову 7733 — спермой быка 2073. Во второй раз корову 2906 осеменили спермой быка 2352, а корову 7733 — спермой быка 4262. ^кие быки являются отцами потомков коров 2906 и 7733?

У коров продолжительность течки значительно варьирует. При осеменении в две последующие течки спермой разных быков около 6 % телят рождается в один и тот же период и отцом их может быть как первый, так и второй бык.

Потомок 3699 не унаследовал ни одного аллеля В-системы быка 4032 (Q или I1G’), ни два аллеля 2-й системы. У этого потомка кроме материнского аллеля I1Y2A’, подтверждающего подлинность матери, обнаружен аллель А’В’, имеющий­ся у быка 2352. Следовательно, фактическим отцом является бык 2352.

Задание 1. Уточните отцовство потомков швицких быков (табл. 29) от выбывших матерей по группам крови и полиморф­ным белкам: гемоглобину (Hb), трансферрину (Tf) и карбоангид- разе (Са). Определите вероятного отца по группам крови по дан­ным иммунногенетического теста (табл. 30).


Задание 2. Установите, соответствует ли происхождение потом­ков данным, записанным в таблице 31.

Задание 3. Проанализируйте результаты скрещивания зебувид- ных коров со швицкими быками-производителями (табл. 32).

Определите частоту аллелей трансферринов TfA, Tf°, Tf® в за­висимости от кровности. Какая закономерность прослеживается? Определите ожидаемую частоту генотипов.

Задание 4. У цветных каракульских овец выявлены генетиче­ские варианты гемоглобина (табл. 33).


Определите частоту аллелей HbA и HbB у овец каракульской породы. Отличаются ли овцы по цвету в зависимости от типа ге­моглобина?

Задание 5. При иммунологическом исследовании у кур обнару­жен антиген Ci системы групп крови С, а антигены С2, С3, С4 от­сутствуют. У петуха обнаружен антиген С4, но нет антигенов С1, С2, Сз.

Ожидается ли в первом поколении расщепление потомства по системе групп крови С?

Задание 6. Свиноматку осеменили спермой двух хряков. Ре­зультаты иммунологического исследования родителей и потом­ства приведены в таблице 34.

Какие антигены могут и какие не могут быть использованы для установления отцовства?

Контроль генетического сходства потомков с родоначальниками. Группа животных, происходящих от
выдающегося родоначальника, сходная с ним по типу телосложе­ния и продуктивности, составляет линию. Ценность родоначаль­ника определяется накоплением в его генотипе многих генов, обусловливающих высокую продуктивность. Линия поддержива­ется целенаправленным отбором и подбором, генетически марки­руется.

Метод маркирования линий, разработанный В. Н. Тихоновым, А. М. Машуровым и др., позволяет поддерживать генетическое сходство с родоначальником и одновременно осуществляет конт­роль за происхождением.

При составлении схем линий и семейств в животноводстве принято обозначать квадратиком мужских особей, кружком — женских особей. Родоначальника выделяют квадратиком большей величины. От родоначальника ведут линии и соединяют с квадра­тиками, обозначающими сыновей родоначальника, затем внуков и т. д. Потомков располагают ниже родителей. В линию входят мужские особи, но при необходимости анализа включают в схему и женские особи.

Пример. Проанализируйте известную в симментальской породе линию быка Флориана 374, маркированную аллелем O3QA2‘E1‘F’J2 (рис. 46).

При совершенствовании линии Флориана на племзаводе «Еланский» из шести его сыновей для продолжения линии были отобраны два сына — Аполлон 773 и Арал 1331. У Арала 1331 было 44 потомка, 26 из которых имели аллель родона­чальника. 315 внуков Флориана передали аллель родоначальника 249 потомкам (правнукам). Бык Монолит 4262 — правнук Флориана — является гомозиготным по этому аллелю. Три правнука Флориана дали 263 потомка, из которых 173 име­ли аллель родоначальника. Правнуки (четвертое поколение) дали 155 потомков, из которых 103 имели аллель родоначальника (рис. 47).

Поддержание генетического сходства с родоначальником по­вышает и поддерживает гомозиготность на достаточно высоком уровне, не вызывая инбредной депрессии.

Для маркирования линий можно использовать коэффициент иммуногенетического сходства (КИС), вычисляемый по формуле

КИС можно вычислить и по группам крови, и по полиморф­ным системам белков. Но точность оценки требует использования большого числа систем.

Задание 7. В племобъединение поступили быки, записанные в родословной как потомки производителя 209 от разных матерей. В результате иммунологической проверки установлены следую­щие генотипы быков в системе В групп крови:

Подтвердите или опровергните генетическое сходство посту­пивших быков с родоначальником на основании систем групп крови.

Определение зиготности близнецов иммуно­генетическим методом. При отборе близнецов очень важ­но определить их зиготность (моно- или дизиготность). Использо­вание групп крови эффективно дополняет метод определения зи­готности близнецов по морфологическим признакам.

Диагностика зиготности основана на индивидуальности типов крови у животных. У монозиготных близнецов отмечают полную идентичность типов крови. Дизиготные близнецы имеют либо разные типы крови (когда между ними не было эмбриональных сосудистых анастомозов), либо у них выявляют мозаику эритро­цитов (химеризм), которая указывает на смесь двух типов крови (когда имели место сосудистые связи). В образовании мозаич­ности эритроцитов участвуют все антигены групп крови, кроме антигена L, который у новорожденных телят находится в плаз­ме и переходит на эритроциты через несколько недель после рождения.

Пример. Определить зиготность двоен от коровы холмогорской породы на ос­нове гемолитического теста образцов крови близнецов (табл. 35).

У первой пары бычков-близнецов наблюдают полный гемолиз (полное ра­створение эритроцитов) в антисыворотках А2, В, W, F, Z. Полный гемолиз обо­значают цифрой 4, частичный гемолиз — цифрами 3, 2, 1 и знаком «+».

У близнецов второй пары установлен полный гемолиз, но не в одних и тех же антисыворотках. Телочки 106 и 107 четко различаются по антигенам D’, I’, V и Z. Они являются дизиготными, и между ними в эмбриональный период не было об­щего кровообращения.


Задание 8. Определите зиготность трех пар близнецов, полу­ченных от коровы симментальской породы, по данным гемолити­ческого теста (табл. 36).


Сколько получено монозиготных, дизиготных мозаичных и ди­зиготных немозаичных близнецов? Можно ли установить генотип у дизиготных близнецов только по выявленным антигенам групп крови, не прибегая к семейному анализу?

Задание 9. Определите зиготность близнецов и генотипы по­томков по данным таблицы 37. Можно ли установить генотипы третьей пары близнецов?

Задание 10. При реципрокном спаривании свиней по иммуно­генетическим различиям получены показатели, приведенные в таблице 38

Вычислите теоретически ожидаемые генотипы и сравните их с фактическими. Объясните полученные результаты.

Задание 11. У лошадей английской чистокровной породы чаще, чем у других пород, встречается гемолитическая болезнь, обусловленная геном А, вызывающим образование антител. При спаривании кобылы с генотипом аа с жеребцом АА первый жере­бенок родился здоровым. От второй жеребости жеребенок по внешнему виду был здоровый, но имел признаки гемолитичес­кой болезни.

Дайте объяснение причин гемолитической болезни. Какие меры нужно предпринять, чтобы жеребенок остался живым? Ка­кова вероятность рождения жеребят с гемолитической болезнью от гетерозиготного жеребца и гомозиготной кобылы? Является ли гемолитическая болезнь наследственным заболеванием?

Задание 12. От дюрок-джерсейской свиноматки было получено 6 пометов, причем последние 5 — от одного хряка. Все поросята первых 4 пометов были здоровыми. В 5-м помете родилось 13 по­росят, и все они погибли через 9—12 ч после рождения. В 6-м по­мете родилось 11 поросят, которые в течение 12 ч после рождения также погибли.

Чем объясняется, что поросята первых 4 пометов были здоро­вы? Можно ли было спасти поросят в 5-м и 6-м пометах? Какие меры надо было предпринять для этого?

Задание 13. От двух баранов каракульской породы с генотипом у первого AmA/B, у второго AmC/C получено 150 потомков со следую­щими генотипами: AmA/A = 3, AmA/B = 15, AmA/C = 9, Атв/в = 27, AmB/C = 66, AmC/C = 30.

Можно ли определить потомков обоих баранов?

Задание 14. Определите частоту аллелей церуллоплазмина Ср^^- и СрВ, карбоангидразы Сар и Сая, амилазы AmB и AmC у зебувидного, швице-зебувидного, швицкого и бурого карпатского скота (табл. 39). Соответствует ли распределение фенотипов теоретически ожи­даемым?


Задание 15. В сыворотке молока коров бестужевской, шорт- горнской, айрширской, черно-пестрой и голландской пород вы­явлены следующие типы р-лактоглобулина (р-lg), приведенные в таблице 40.

Рассчитайте частоту генов P-lgA и P-lgB. Имеется ли генное равно­весие по локусу р-Lg? Установите возможность применения р-lg ло­куса в качестве генетического маркера породной принадлежности.

Диагностика фримартинизма. У крупного рогатого скота двойни бывают одно- и двуяйцовые. Если двуяйцовые двой­ни разнополые, то телки из них часто бывают бесплодными (фри- мартинизм). Для разнояйцовых двоен, имеющих эмбриональные сосудистые связи, характерен мозаицизм антигенов групп крови (табл. 41) и химеризм в системе половых хромосом (XX/XY).

В таблице 41 дан пример расшифровки генотипа быка, рожден­ного в двойне, с помощью анализа В-локуса групп крови. Всем своим потомкам бык-мозаик передает два аллеля BI1Q и I1E1G». Следовательно, антигены G, K, E ,1, 03, F’, I’, O’, Q’ были получе­ны быком-мозаиком от своего близнеца и не были детерминиро­ваны собственным генетическим аппаратом. У однояйцовых дво­ен группы крови идентичны.

Задание 16. Проведите генотипический анализ систем групп крови близнецов по данным таблицы 42 и установите возмож­ность проявления у них химеризма и фримартинизма.

Задание 17. Пользуясь демонстрационным материалом препо­давателя, определите, по каким локусам микросателлитов ДНК наблюдают отличия генотипов отец—потомок—мать. Какие выво­ды можно сделать из результатов этого анализа?

Название книги — Практикум по ветеринарной генетике

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *