Занятие 9-10 мутационная изменчивость

ТЕМА 4

ЗАНЯТИЕ 9

ЧИСЛОВЫЕ И СТРУКТУРНЫЕ МУТАЦИИ ХРОМОСОМ

Цель занятия. Изучить механизм возникновения хромосомных мутаций у сельскохозяйственный животных и влияние хромосомных мутаций на воспроиз­водительные качества, продуктивность и жизнеспособность потомства.

Материалы и оборудование. Микроскоп, микропрепараты, таблицы, схемы, красители Гимзы и родамин, дистиллированная вода, 0,2 н. раствор НС1, 5%-ный раствор Ва(ОН)2, 0,25%-ный раствор серебра, 5-бромдезоксидридин, 0,005%-ный раствор колхицина, биотин, дигоксигенин, предметные и покровные стекла, чаш­ки Петри, термостат.

Содержание занятия. Современные цитогенетические методы исследования позволяют выявлять среди сельскохозяйственных животных особей с хромосомными аномалиями, влияющими на воспроизводительные способности, продуктивные качества и жизнеспособность их носителей.

Отрицательный эффект таких мутаций многократно возрастает при искусственном осеменении сельскохозяйственных животных из-за интенсивного использования производителей — носителей мутаций.

Механизм образования геномных мутаций. Раз­личают следующие типы хромосомных мутаций: геномные, или числовые, и хромосомные, или структурные (аберрации).

Геномные, или числовые, мутации — это мутации, сопровож­дающиеся изменением числа хромосом в кариотипе. Их подразде­ляют на гетероплоидию и полиплоидию.

Полиплоидией называют увеличение числа полных наборов хро­мосом в четное или нечетное число раз. Полиплоидные клетки могут быть триплоидными (3n), тетраплоидными (4n), пентапло- идными (5n) и т. д. Организмы, у которых произошло умножение целых гаплоидных наборов, называют собственно полиплоидами.

Возникновение полиплоидных тканей и организмов, развива­ющихся из соматических клеток, называют митотической поли­плоидией. В этом случае клетки будут полиплоидными только в той части организма, которая разовьется из исходной полиплоидной клетки, и организм окажется химерным.

Стадии, на которых возможно возникновение полиплоидии.

  1. Митотическая полиплоидизация — удвоение числа хромосом в соматических клетках без цитокенеза.
  2. Зиготическая полиплоидизация в результате удвоения числа хромосом в зиготе без первого деления.
  3. Мейотическая полиплоидизация из-за отсутствия редукции при образовании гамет.

Явление полиплоидии часто встречается у растений и исполь­зуется для выведения новых сортов. Среди млекопитающих по­липлоидия очень редка и чаще всего детальна. Вместе с тем в организме сельскохозяйственных животных полиплоидные клет­ки можно наблюдать в печени, крови и других тканях. Увеличе­ние плоидности клеток, например клеток крови, является факто­ром предрасположенности крупного рогатого скота к лейкозу (рис. 18).

Гаплоидия — явление, при котором соматические клетки содер­жат не диплоидный (2n), а гаплоидный (n) набор хромосом.

Гаплоидные особи развиваются из неоплод отворенного яйца, в партеногенезе. Например, у пчелиного трутня 16 хромосом (n) в от­личие от матки и рабочей пчелы, у которых 32 хромосомы (2n).

Гетероплоидия — это уменьшение или увеличение в кариотипе животного на одну, реже на две хромосомы (2n ± 1; 2n ± 2). Чаще всего гетероплоидия у высших животных выражается в форме ане-

уплоидии, когда число хромосом в клетке увеличено на одну хро­мосому (2n + 1) — трисомия или уменьшено на одну (2n — 1) — моносомия либо на две хромосомы (2n — 2) — нуллисомия (рис. 19). Истинная анеуплоидия возникает при нарушении мейоза (нерас­хождение хромосом), когда две гомологичные хромосомы либо не конъюгируют в зиготенной фазе мейоза, либо между ними не об­разуется перекрест. Неконъюгированные или преждевременно ра­зошедшиеся хромосомы распределяются в анафазе случайно либо к одному полюсу обе, либо к разным полюсам, в результате чего и образуются половые клетки с нехваткой или избытком одной, реже двух хромосом.

Различают гоносомальную (по половым хромосомам) и аутосо- мальную анеуплоидию. Чаще встречаются особи с гоносомальной анеуплоидией (табл. 6). К ней относят трисомию XXX, XXYи мо- носомию ХО. Трисомия XXYтипична для синдрома Клайнфельте- ра, для которого характерно недоразвитие, евнухоидизм, гипопла­зия семенников и т. п. Анеуплоидию чаще всего наблюдают по по­ловым хромосомам, потому что утеря аутосом в большинстве случаев обусловливает гибель эмбриона на ранних стадиях эмбрио- генеза (табл. 7).

У крупного рогатого скота по половым хромосомам встречают­ся варианты XXY, XYY (рис. 20), XXX, ХХХХ. Это приводит к гер­мафродитизму (нарушение воспроизводительной функции, бес­
плодие), хотя по внешним признакам их носители почти не отли­чаются от нормальных животных.

Мозаик — это организм, развившийся из одной зиготы одного и того же генотипа, но содержащий более одного кариотипа.

Химера — это организм, развившийся из двух зигот разных ге­нотипов. Химеризм может затрагивать только кроветворные орга­ны или все тело. Химеризм по половым хромосомам (фримарти- низм) возникает как результат сосудистых анастомозов между раз­нополыми эмбрионами в утробе матери. Мужские гормоны начинают вырабатываться раньше и подавляют нормальное разви­тие самок, до 90 % которых оказываются в итоге бесплодными. Кроме того, через кровоток эмбрионы обмениваются клетками и у них возникают химерные ткани. Быки-химерики (60,ХХ/60,ХУ) иногда даже при высокой концентрации клеток с женским карио­типом (до 50 % и более) не отличаются от нормальных сверстни­ков по воспроизводительным качествам. Иногда же отмечают снижение воспроизводительных способностей, низкую оплодот­воряющую способность спермы. Химеризм по половым хромосо­мам не передается по наследству, однако при моносомии или три- сомии могут образовываться несбалансированные гаметы, участие которых в оплодотворении может привести к образованию эмб­рионов с аномалиями и уродствами в развитии (дефектных по ка­риотипу эмбрионов).

Задание 1. Рассмотрите под микроскопом и на слайдах препа­рат культуры клеток крови сельскохозяйственных животных с поли- и гетероплоидией (трисомией, моносомией).

Задание 2. По фотографиям и слайдам постройте кариограмму животных с трисомией, моносомией, полисомией.

Хромосомная аберрация — это изменение структуры одной или нескольких хромосом. Различают следующие типы хромосомных аберраций: транслокации, инверсии, делеции, дупликации, коль­цевые хромосомы, изохромосомы.

Транслокация — перемещение отдельных фрагментов хромосом из одного участка в другой, обмены фрагментами между разными хромосомами, слияние хромосом.

Различают реципрокные и нереципрокные, тандемные и ро­бертсоновские транслокации.

Реципрокные транслокации — это взаимный обмен фрагментами негомологичных хромосом (рис. 21).

Нереципрокные транслокации — это перенос участка одной хро­мосомы на другую (рис. 22).

Тандемные транслокации — это присоединение целого плеча одной хромосомы к плечу другой хромосомы (рис. 23).

Робертсоновские транслокации — это слияние двух акроцент- рических хромосом в области центромер. При этом из двух об­разуется одна мета- или субметацентрическая хромосома (рис. 24).

Инверсия — оторвавшийся фрагмент разворачивается на 180° и прикрепляется другим концом (рис. 25).

Делеция — потеря среднего фрагмента хромосомы (рис. 26). Дупликация — удвоение отдельных участков хромосом.

Кольцевые хромосомы образуются при наличии двух концевых разрывов.

Методы окраски хромосом. Существует несколько методов окраски хромосом для выявления аберраций различных типов.

При сплошной монохромной окраске хромосом фиксированный пре­парат окрашивают раствором красителя Гимзы в стакане на 50 мл в течение 5—20 мин (стандартное время 5 мин), затем ополаскива­ют в дистиллированной воде и высушивают. Качество окраски контролируют под микроскопом.

При дифференциальной С-окраске обработку препарата 0,2 н. ра­створом HCl проводят в вертикальном положении при комнатной температуре в течение 10—60 мин, затем ополаскивают в дистил­лированной воде. Далее препарат обрабатывают 5%-ным раство­ром Ba(OH)2 в вертикальном положении в течение 1—15 мин (обычно 5 мин) при 60—65 °С (критическая стадия), отмывают в 0,2 н. растворе HCl и ополаскивают дистиллированной водой. В чашке Петри в растворе 2х88С препарат выдерживают в тече­ние 60—90 мин при 60—65 °С, а затем окрашивают красителем Гимзы в стакане на 50 мл в течение 15—30 мин (препарат перено­сят в краску сразу из 2х88С). Ополаскивают дистиллированной водой и высушивают. Качество окраски контролируют под микро­скопом.

Препараты у видов животных с небольшим количеством струк­турного гетерохроматина требуют щадящих предобработок и бы­стро утрачивают способность к С-окрашиванию, виды с большим количеством гетерохроматина (мыши, крупный рогатый скот, ло­шади) хорошо окрашиваются по С-методу почти во всех режимах и долго сохраняют способность к окрашиванию (рис. 27).

С-окраску препаратов хромосом используют в основном для определения локализации центромер, выявления отдельных структурных аберраций.

При дифференциальной G-окраске фиксированный препарат об­рабатывают 0,25%-ным раствором трипсина от нескольких секунд до 1 ч, ополаскивают в растворе 2х88С (для прекращения дей­ствия трипсина). Затем препарат окрашивают красителем Гимзы в стакане на 50 мл в течение 5—20 мин, ополаскивают в дистилли­рованной воде и высушивают. Качество окраски контролируют под микроскопом.

Одним из основных условий качественной G-окраски является правильно подобранный срок хранения препарата от фиксации до окраски (так называемое старение препарата) и время обработки в трипсине. Свежие препараты, как правило, окрашиваются плохо. Наиболее оптимальные результаты дает окрашивание препаратов 2—4-недельной давности.

Немаловажное значение для лучшего G-окрашивания имеет качество красителя. Можно использовать готовый краситель Гим- зы (или азур-эозин по Романовскому), но лучше краситель гото­вить самим. Для этого смешивают 125 мл метанола и чистого гли­церина, добавляют 2 г сухого красителя и смесь в колбе переме­шивают на магнитной мешалке в течение 1 ч. После этого краситель фильтруют и хранят в темной посуде.

Окрашенные препараты необходимо хранить в коробках, так как на свету они быстро выцветают. Следует избегать заключения препаратов в бальзам, потому что это также приводит к быстрому их обесцвечиванию. В плотно закрытых коробках окрашенные препараты могут храниться длительное время.

Дифференциальную G-окраску применяют для идентифика­ции пар гомологичных хромосом и выявления структурных и чис­ловых аберраций (рис. 28, 29).

При Ag-окраске на предметное стекло с препаратом наносят 2 капли проявляющего раствора желатина и 4 капли 50%-ного ра­створа серебра и накрывают покровным стеклом. Препарат поме­щают во влажную камеру и в термостат при температуре 60—65 °С на 5 мин (время может варьировать от 3 до 15 мин). Покровное стекло удаляют, препарат ополаскивают в воде и высушивают.

Проявляющий раствор и раствор азотнокислого серебра можно хранить в закрытых сосудах достаточно долго. Однако наилучшие результаты дают свежеприготовленные растворы.

Для идентификации хромосом, несущих ядрышковый органи­затор, после окраски серебром используют два способа перекрас­ки препаратов.

  1. Препараты помещают в раствор трипсина и затем окраши­вают красителем Гимзы. В этом случае на одном и том же препа­рате выявляют и окрашенную зону ядрышкового организатора, и G-дифференциально окрашенные хромосомы. Время обработки трипсином такое же (или чуть больше), как и при фиксации до окраски препарата серебром.
  2. Метафазные пластинки с окрашенными ядрышковыми организаторами фотографируют, отмывают от иммерсионного масла в ксилоле, проводят через метанол-уксусный фиксатор и высушивают. Серебро удаляют ополаскиванием препарата в 5— 10%-ном растворе красной кровяной соли. От последней препарат отмывают проточной водой и высушивают. Обработанный таким образом препарат можно использовать для рутинной, G- и С-ок- расок. Время обработки трипсином при G-окрашивании иногда уменьшают в 2—3 раза по сравнению с установленным для этой фиксации.

Выявление сестринских хроматидных обме­нов. Для выявления сестринских хроматидных обменов (СХО) используют метод с применением 5-бромдезоксиуридина (БДУ) и термической обработки. В результате достигается четкое диффе­ренциальное окрашивание сестринских хроматид с хорошо види­мыми обменами.

Культивирование клеток крови осуществляют общепринятым методом, используемым при приготовлении цитогенетических препаратов. За 28 ч до съема культуры в каждый культуральный флакон вводят БДУ в конечной концентрации 10 мкг/мл. За 1,5 ч до окончания культивирования вводят колхицин (0,005 %), а за­тем проводят обычные процедуры по съему культуры клеток кро­ви. Дважды сменив фиксатор, высушивают препарат на воздухе. По истечении 3—5 сут окрашивают препараты на СХО.

Свежеприготовленный 1 M раствор Na 2HPO4 • 12H2O нагревают в сушильном шкафу до температуры 87 °С, после чего в раствор опус­кают готовые препараты и выдерживают в шкафу 20 мин. Затем их извлекают из раствора, несколько раз промывают в дистиллирован­ной воде, высушивают и красят. Для окраски используют краситель Гимзы (3 мл маточного раствора доводят до 100 мл фосфатным буфе­ром — рН 6,8). При хорошем красителе препараты держат в растворе 30—60 с. В остальных случаях время подбирают эмпирически. Окра­шенные препараты промывают, высушивают и анализируют.

В препаратах, окрашенных описанным выше способом, хромо­сомы напоминают одежду арлекинов (рис. 30) из-за чередования в шахматном порядке по длине сестринских хроматид светлых и

темных участков, что свидетельствует о многочисленных актах го­мологичных обменов между этими хроматидами.

Количество обменов определяют путем подсчета числа перехо­дов темной окраски с одной хроматиды на другую (это же отно­сится и к переходу светлой окраски). Число СХО на метафазу под­считывают путем деления общей суммы обменов у каждого живот­ного на количество исследованных метафаз.

Задание 3. Изучите на метафазных препаратах особенность дифференциальных С-, G-, Ag-окрасок и запишите в тетрадь.

Метод флюоресцентной гибридизации in situ (FISH). Принцип этого метода состоит в следующем. Для изучае­мой хромосомы или конкретного ее участка, исходя из специфич­ности последовательности основания ДНК, готовят однонитевой участок ДНК, к которому присоединяется биотин и дигоксиге- нин. Такой «помеченный» участок ДНК называют зондом. На микроскопическом препарате in situ при щелочной обработке хро­мосомная ДНК денатурируется, т. е. разрываются связи между двумя нитями ДНК. Зондом обрабатывают препарат. Поскольку последовательность оснований ДНК зонда и соответствующий участок хромосомы взаимно комплементарны, зонд присоеди­няется к хромосоме. В этом участке происходит ренатурация ДНК. После этого препарат обрабатывают веществом, которое благодаря своей структуре способно избирательно присоеди­няться к биотину или дигоксигенину. Для биотина таким веще­ством является стрептавидин, для дигоксигенина — антидигоксигениновое антитело.

К этим веществам могут быть присоединены в один или два этапа флюоресцентные красители (родамин — кра­сный цвет или флюоресцеин изитиоционат — зеленый цвет). С по­мощью люминесцентного микроскопа окрашенные хромосомы видны на фоне неокрашенных.

На рисунке 31 приведена схема двойной гибридизации. Совре­менные методические возможности позволяют увеличить число цветов. Однако пользоваться большим количеством флюоресцент­ных красителей приходится редко.

Границы применения метода FISH очень широкие: от опреде­ления локализации гена до расшифровки сложных перестроек между несколькими хромосомами. Молекулярно-генетические и цитологические методы делают почти неограниченными возмож­ности диагностики хромосомных аномалий, как очень сложных, так и очень мелких по размерам. Дву- и трехцветные флюоресцен­тные гибридизации in situ применяют для учета симметричных хромосомных аберраций при облучении ионизирующими излуче­ниями много лет. Указанный метод требует меньше времени, чем кариотипирование дифференциально окрашенных метафаз.

В случаях сложных хромосомных перестроек, захватываю­щих более двух хромосом, дифференциальная G-окраска не всегда позволяет идентифицировать измененные сегменты хро­мосом. В этих случаях применяют трехцветный вариант метода FISH. Например, у ребенка с множественными врожденными аномалиями при G-анализе обнаружены сложные перестройки в нескольких хромосомах (1; 4; 8; 9 и 12) с 10 разрывами. Пол­ная идентификация разрывов возможна только с помощью FISH-окраски.

Метод FISH можно применять для диагностики анеуплоидий в интерфазных ядрах. Принцип метода в этом варианте такой же, как и для метафазных пластинок. Например, специфичный для 21-й хромосомы зонд ДНК, соединенный с биотопом, гибридизи­руется с денатурированными клетками из амниотической жидко­сти на предметном стекле. В норме, т. е. если у плода есть дисомия по 21-й хромосоме, в ядре будут видны две флюоресцирующие со­ответствующим цветом точки. Если же плод трисомный, то в ядре будут видны три точки. Такой методический прием называют ин­терфазной цитогенетикой. Метод прост, экономичен и требует мало времени (несколько часов).

При анализе структуры хромосом используют условные обо­значения:

короткое плечо хромосом — «р»;

длинное плечо — «q»;

потеря участка хромосом — «—»;

добавление участка — «+»;

транслокация — «tr»;

реципрокная транслокация — «rcp»;

робертсоновская транслокация — «trRob»;

делеция — «del»;

дупликация — «dup»;

ломкий сайт — «fra»;

изохромосома — «i»;

инверсия — «inv»;

кольцевая хромосома — «г».

Аберрации хромосом у крупного рогатого скота. У крупного рогатого скота обнаружены разные формы числовых и структурный аномалий кариотипа, которые сочетают­ся с эмбриональной смертностью, интерсексуальностью, злокаче­ственными процессами (лейкоз, саркома и др.), врожденными аномалиями обмена веществ и т. д.

Из числовых мутаций у крупного рогатого скота регистрируют в основном трисомию, моносомию, нуллисомию и полисомию, кото­рые обычно вызывают летальный исход уже на ранних стадиях эмб­рионального развития (рис. 32). После рождения отмечают числовые мутации только по мелким аутосомам и половым хромосомам.

У крупного рогатого скота наиболее изучен робертсоновский тип транслокаций между 1-й и 29-й аутосомами. Транслокация 1/29 аутосом снижает плодовитость и продуктивность животных.

Наличие робертсоновской транслокации (аберрантной хромо­сомы) ведет к нарушению расхождения хромосом в мейозе, вслед­ствие чего образуются гаметы с несбалансированным набором хромосом (рис. 33). Оплодотворение несбалансированных гамет ведет к ранней эмбриональной смертности, вследствие чего нара­стает количество перегулов. Установлено, что у дочерей быков с

робертсоновскими транслокациями 1/29 показатели оплодотворе­ния снижены на 6—10 %. Известны также слияния аутосом: 1/25; 1/27; 1/28; 2/24; 3/4; 3/27; 5/15; 5/18; 5/23; 5/21 и др.

Инверсия по разным хромосомам влияет на снижение воспро­изводительной способности животных и в том числе может быть причиной бесплодия быков.

Делеции, нехватки, поломки хромосом вызывают обычно ле­тальный эффект на ранних стадиях онтогенеза. Их также отмеча­ют у животных с различными патологиями (лейкоз, паракератоз).

Задание 4. На препаратах и слайдах изучите характерные осо­бенности кариотипов крупного рогатого скота с различными му­тациями (моно-, полисомией, транслокациями).

Задание 5. Определите кариотипы эмбрионов при следующих подборах.

  1. Бык гетерозиготный по транслокации, корова имеет нор­мальный кариотип.
  2. Бык и корова — гетерозиготные носители транслокации 1/29.
  3. Бык — гомозиготный носитель транслокации 1/29, корова имеет нормальный кариотип.
  4. Бык гомозиготный, корова гетерозиготная по транслока­ции 1/29.

Рассчитайте проценты эмбриональных потерь при каждом ва­рианте скрещивания.

Аберрации хромосом у свиней. У свиней отмечают высокий уровень хромосомных аберраций, большая часть которых летальна (рис. 34, 35). Наиболее изучены реципрокные транслока­ции, которые существенно снижают воспроизводительные каче­ства свиней (табл. 8).

У свиней установлено более 20 реципрокных транслокаций, которые снижают жизнеспособность потомков от 25 до 50 %.

Задание 7. По данным таблицы 10 определите типы гамет, образующихся у гетерозиготных носителей транслокации, и ка­риотипы их потомства. Рассчитайте процент эмбриональных потерь при условии, если один (или оба) родитель носитель транслокации.

Аберрации хромосом у овец. У овец также обнаруже­но несколько типов аберраций хромосом, отрицательно влияю­щих на плодовитость и жизнеспособность.

Задание 8. На препаратах и слайдах изучите характерные хро­мосомные мутации у овец.

Задание 9. Зарисуйте схематически: а) робертсоновские транс­локации у овец; б) реципрокные транслокации.

Определите типы гамет у гетерозиготных носителей этих типов аберраций.

Аберрации хромосом у лошадей. У этого вида жи­вотных наиболее часто встречающиеся нарушения в системе поло­вых хромосом приводят к стерильности (рис. 36, табл. 11).


Задание 10. Изучите характер числовых и структурных аберра­ций у ло0адей и запи0ите в тетрадь.

Задание 11. Определите типы гамет у ло0адей — полных носи­телей и мозаиков синдромов Тернера, Клайнфельтера. Какие бу­дут кариотипы эмбрионов, если:

а) кобылу мозаик (ХО/ХХ) спаривали с жеребцом нормального кариотипа;

б) жеребца мозаичного носителя синдрома Клайнфельтера (XXY/ XY) спаривали с кобылой нормального кариотипа (XXY/XY/XYY).

Рассчитайте эмбриональные потери, если жеребца мозаика ис­пользовали для покрытия 100 кобыл. От чего зависят эти потери? Используя данные таблицы 11, смоделируйте другие варианты скрещивания ло0адей с гоносомальными аберрациями. Объясни­те их последствия, в том числе рассмотрите вариант, при котором возможен сдвиг в соотно0ении полов.

ЗАНЯТИЕ 10

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПОСЛЕДСТВИЯ ЗАГРЯЗНЕНИЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

Цель занятия. Изучить особенности воздействия радиации и других факторов вне0ней среды на частоту хромосомных аберраций.

Материалы и оборудование. Таблицы.

Содержание занятия. Мутагены, канцерогены и тератогены, за­грязняющие окружающую среду, способны изменять наследствен­ный аппарат животных и растений и вызывать появление мутций злокачественных образований, особей с врожденными поро­ками развития и ряд других патологий.

Установлено, что в среднем по зонам с уровнем радиоактивно­го загрязнения 35—100 бэр отклонения от нормального кариотипа у крупного рогатого скота составили 29,0 %, 7—35 бэр — 24,8 %, менее 7 бэр — 17,8 % (Ш. А. Мкртчан и др., 1993). С возрастанием уровня радиации выявлено увеличение числа животных с поли­плоидией клеток крови.

Задание 1. Проанализируйте данные таблицы 12 и дайте оценку влияния уровня радиации на частоту и характер аберраций у круп­ного рогатого скота

Задание 2. Используя данные таблицы 13, установите достовер­ность влияния уровня радиации на количество разрывов хромо­сом.

Для оценки генетических последствий загрязнения окружаю­щей среды во многих странах в качестве теста на мутагенность ис­пользуют тест на СХО. Одну из групп химических индукторов СХО составляют вещества, широко используемые в сельском хо­зяйстве: гербициды, пестициды, минеральные удобрения, лекар­ственные препараты, промышленные отходы.

Задание 3. Изучите воздействие факторов внешней среды (по данным таблицы 14 или по заданию преподавателя) на животных в различных экологических зонах, используя тест на СХО.

Название книги — Практикум по ветеринарной генетике

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *