Занятие 2 кариотип и его особенности у животных различных видов и птицы

ЗАНЯТИЕ 2

Цель занятия. Изучить строение хромосом, структуру и особенности нормаль­ных кариотипов сельскохозяйственных и домашних животных и птицы.

Материалы и оборудование. Микроскоп, микропрепараты, таблицы, схемы.

Содержание занятия. Строение хромосом. Изучение ядра клетки под электронным микроскопом показало, что в нем со­держатся нитевидные образования, получившие названия хромо­сом. Эти структурные элементы клетки представляют собой ма­териальную основу наследственности, так как они содержат в себе ДНК.

Общая морфология хромосом лучше всего выявляется на ста­дии метафазы и ранней анафазы, когда хромосомы наиболее уко­рочены и находятся в экваториальной плоскости клетки. Для каж­дого вида характерны определенное число, форма и структура хромосом. Совокупность хромосом называют хромосомным набо­ром. Число хромосом в соматических клетках обычно двойное (диплоидное). Оно обусловлено слиянием двух гамет, содержащих гаплоидные наборы хромосом.

Гаплоидный набор хромосом обозначают «я», а диплоидный — «2я». Диплоидный набор хромосом соматических клеток называ­ют кариотипом.

Хромосома состоит из двух разделенных узкой щелью вдоль ее оси половинок, называемых хроматидами. Каждая хроматида включает одну или несколько спирально закрученных тонких нитей, расположенных параллельно оси хромосомы, — хромо­нем. Участки наиболее плотных завитков спирали хромонем на­зывают хромомерами. Каждая хромосома имеет первичную пере­тяжку, которая представляет собой неспирализованный участок хромосом, где расположена центромера (кинетохор). Первич­ная перетяжка делит хромосому на два плеча. В зависимости от расположения перетяжки выделяют несколько типов хромосом (рис. 4).

Хромосомы, которые имеют вторичную перетяжку, называют спутничными. Место формирования ядрышка называют организа­тором ядрышка, или вторичной перетяжкой.

Различают эухроматиновые (менее спирализованные) и гете­рохроматиновые (более спирализованные) участки хромосом. Ге­терохроматиновые и эухроматиновые участки обладают различ­ными генетическими свойствами. Первые почти не содержат ге­нов и наследственно инертны, тогда как вторые содержат гены и наследственно активны. Гетерохроматиновые участки разбросаны по всей длине хромосом, но обычно располагаются вблизи цент-


ромеры. В них чаще происходят разрывы, чем в эухроматиновых участках или на границе с последними.

Гетерохроматиновые участки хромосом выполняют в ядре ряд функций, они содействуют упорядоченному взаиморасположению хромосом в период развития клетки и их обособлению во время деления ядра.

В зависимости от условий в хромосомах воспроизводится не­одинаковое количество гетерохроматина и активно действующих генов, что способствует развитию приспособительных реакций организма.

Гистоны образуют в хромосоме основу так называемых нуклео- сом, благодаря которым нить ДНК может перегибаться. В резуль­тате этого обеспечивается компактная упаковка нити ДНК внутри ядра (сфера с диаметром порядка микрона вмещает нить длиной около метра).

Кариотипы особей мужского и женского пола одного вида раз­личаются только по одной паре хромосом, которые называют поло­выми хромосомами, или гоносомами. Их обозначают через X и Y (у млекопитающих), остальные хромосомы называют аутосомами.

Измерение хромосом. Важное значение для определе­ния и классификации отдельных хромосом имеет их длина. Длина каждой хромосомы определенного набора относительно постоян­на. Поэтому измерение хромосом необходимо для изучения их из­менчивости в онтогенезе в связи с болезнями, аномалиями, нару­шением воспроизводительной функции. Измерение длины хро­мосом, отдельных плеч проводят на фотографии, а также под микроскопом. Для этого необходимо знать истинные размеры од­ной, например, самой большой хромосомы. Предположим, что ее истинная длина равна 3,2 мкм. На фотографии ее длина 15 мкм. Определяем увеличение фотоаппарата: 15 000 : 3,2 = 7200 раз. За­тем устанавливаем истинную длину остальных хромосом путем де­ления длины сфотографированной хромосомы на увеличение микроскопа. Например, длина на фотографии равна 10 мм = = 10 000 мкм : 7700 раз = 2,1 мкм.

Абсолютную длину хромосом выражают в мкм, а относитель­ную в процентах по формуле

Источником изучения хромосомных наборов (кариотипа) у сельскохозяйственных животных обычно служит культура интен­сивно делящихся лейкоцитов крови, или клеток костного мозга, позволяющая фиксировать метафазные стадии деления клеток и анализировать хромосомы.

Методика приготовления цитогенетических препаратов для изучения кариотипов животных заключается в следующем: раз­множающиеся в культуре клетки обрабатывают колхицином — ве­ществом, задерживающим митоз на стадии метафазы. Это позво­ляет получить на одном препарате много клеток с отчетливо види­мым хромосомным набором. За несколько минут до фиксации культуру помещают в гипотонический раствор. Набухание клеток способствует более свободному расположению хромосом. Затем клетки фиксируют и окрашивают красителями, избирательно дей­ствующими на хромосомы. На предметное стекло с клетками на­кладывают покровное стекло, под тяжестью которого клетки раз­давливаются. На давленых препаратах (в отличие от резаных на микрометре) опасность потерять часть хромосом отсутствует.

Наиболее доступным методом изучения является метод культу­ры лейкоцитов, заключающийся в следующем.

  1. Из краниальной полой вены стерильным шприцем с раство­ром гепарина (100 мг гепарина на 1 мл воды) берут 10 мл крови. Кровь помещают в плотно закрытые стерильные пробирки, содер­жащие по 0,5 мл гепарина, разведенного со средой 199 в соотно­шении 1 : 4, и тщательно перемешивают. В таком состоянии кровь можно хранить несколько дней и транспортировать.
  2. Пробирку с кровью при температуре 4 °С оставляют на 30—40 мин для осаждения эритроцитов. Плазму с взвешенными в ней лейкоцитами отсасывают через иглу шприцем, разбавляют средой 199 три раза и добавляют фитогемагглютенин (белковое ве­щество из семян фасоли, применяют как стимулятор митотичес­кой активности). В шприце компоненты перемешивают и поме­щают в стерильные, плотно закрытые пенициллиновые флаконы вместимостью 2—3 мл.
  3. Флакон со средой инкубируют в термостате при температуре 37—38 °С в течение 72 ч. Через 68—70 ч после начала инкубации в культуру добавляют 0,04%-ный раствор колхицина (по 0,1—0,5 мл). Культуру встряхивают и оставляют в термостате при температуре 37 °С на 3 ч. По истечении этого времени культуру центрифуги­руют в течение 10 мин при частоте вращения 800 мин-1, надоса- дочную жидкость сливают. В осажденные лейкоциты для набу­хания и перехода хромосом в более рыхлое состояние добавля­

 

ют 5 мл гипотонического раствора. Помещают в термостат на 20—30 мин при температуре 37 °С, после чего снова центрифу­гируют для удаления гипотонического раствора. К осадку осто­рожно по стенкам пробирки добавляют 5 мл фиксатора при температуре 4 °С (1 часть уксусной кислоты и 3 части метилово­го спирта). Фиксация длится в течение 45 мин. На чистые, обез­жиренные и охлажденные в холодильнике предметные стекла пастеровской пипеткой наносят 1—2 капли суспензии лейкоци­тов. Препарат окрашивают 1%-ным раствором ацетоорсеина в течение 30 мин.

Анализ метафазных клеток проводят под микроскопом с окуля­ром х10 объективом х40; для подсчета и их фотографирования ис­пользуют иммерсию.

Использование компьютерных программ для цитогенетического исследования. Для кариотипиро- вания и анализа хромосом животных, в том числе построения идиограм, можно использовать систему автоматического карио- типирования «ВидеоТест-Карио 3.1». Данная система, включаю­щая в себя микроскоп, систему ввода (цифровая камера), компь­ютер и операционную систему для обработки информации, по­зволяет.

  1. Получать изображение метафазной пластинки и проводить подготовку ее к анализу.

Ввод изображения в окно программы можно осуществлять с помощью цифровой камеры, установленной на микроскопе; из файла (формат tif, bmp, jpg); копированием из буфера временного хранения. Полученное изображение можно вырезать в прямо­угольный или произвольный фрагмент (для концентрирования изображения в центре, удаления объектов, не являющихся хромо­сомами), повысить яркость и контрастность, усилить резкость.

  1. Автоматически выделять хромосомы и работать с выделен­ными объектами.

Выделение хромосом на изображении проводится автоматичес­ки, а также может корректироваться пользователем системы. Пос­ле выделения контактирующие и наложенные хромосомы будут разделены и на всех хромосомах автоматически будут построены центральные линии и центромеры.

Возможно редактирование результатов автоматического выде­ления (дорисовка контура хромосом, разделение контактирующих и наложенных хромосом, отмена разделения, корректировка по­ложения центральных линий и центромер).

В этом же режиме можно провести контрастирование всех хро­мосом и заливку фона; предусмотрена также возможность прове­дения ручного кариотипирования, т. е. присвоения номера каж­дой выделенной хромосоме.

  1. Получать кариограммы и работать с ними.

После окончания корректировки выщеленных хромосом про­грамма автоматически раскладывает кариограмму. В кариограмме проводится выравнивание хромосом по центральному, нижнему или верхнему окончанию, а также можно переносить хромосомы из одной ячейки в другую, менять их положение относительно ли­нии выравнивания, поворачивать на 180° или на произвольный угол, отображать зеркально, выравнивать отдельную хромосому или все.

В кариограмме предусмотрена возможность показа стандарт­ных идиограмм хромосом (они могут быть выведены как для всех хромосом, так и для отдельных выгбранных пользователем).

Программа позволяет также нанести текстовой комментарий на изображение кариограммы.

  1. Сравнивать хромосомы и строить идиограмму.

Хромосомы можно сравнивать между собой и со стандартными

идиограммами в специальном поле сравнения, куда они перено­сятся с изображения. В поле сравнения хромосомы можно вы­прямить, привести к одному масштабу, нанести границы бендов, закрасить их и пронумеровать. Построенную идиограмму можно передать в базу идиограмм.

  1. Сохранять результаты анализа и выводить данные на печать.

Изображение хромосом можно сохранить в файле с расшире­нием tif, bmp, jpg. Результаты анализа метафазной пластинки мо­гут быть выведены на печать в виде стандартного бланка, куда ав­томатически переносится информация, внесенная пользователем при заполнении карточки данных.

  1. Сохранять изображения и результаты анализа в базе данных.

Программа имеет встроенную базу данных для изображения

хромосом, которую можно использовать для хранения и последу­ющего быстрого поиска исходных изображений и результатов ана­лизов.

Для работы с системой «ВидеоТест-Карио 3.1» используют ме­тафазные пластинки, подготовленные для анализа в соответствии со стандартной цитогенетической технологией. Система позволя­ет работать с G, Q, R-окрашенными хромосомами.

Задание 1. Рассмотрите под микроскопом лейкоциты крови сельскохозяйственных животных. Найдите метафазные пластинки и подсчитайте число хромосом, отметьте характерные особенно­сти кариотипов животных разных видов.

Задание 2. Изучите характерные особенности кариотипа до­машних свиней, для чего: а) на препаратах под микроскопом най­дите метафазные пластинки; б) постройте кариограмму и класси­фицируйте хромосомы, используя компьютерную программу «Ка- риоТест». При отсутствии данной программы классифицируйте вручную, для этого вырежьте ножницами из микрофотографии все хромосомы и классифицируйте их по группам; в) найдите пар­ные (гомологичные) хромосомы. Убедитесь, что все хромосомы распределены по гомологичности, приклейте их микрофотогра­фии в тетрадь по группам. Сравните построенную вами карио- грамму со стандартной (выявите возможные отклонения по числу хромосом или форме отдельных хромосом).

Особенности кариотипов животных разных видов. По длине и положению центромеры хромосомы домаш­ней свиньи подразделяют на четыре группы (А, В, С и D) (рис. 5).

К группе А относят три пары крупных субметацентрических хромосом с плечами неравной длины, причем отчетливо выделя­ются по размерам самые крупные хромосомы первой пары. Хро­мосомы 2-й и 3-й пар группы А значительно короче. Их длина равна примерно длине большого плеча первой хромосомы.

К группе В относят все акроцентрические хромосомы — шесть пар (с 4-й по 9-ю включительно). Центромера у них расположе­на вблизи одного из концов. Дифференциация хромосом этой группы происходит по их длине. Хромосомы 4-й пары самые крупные, близкие по размеру к хромосомам 1-й пары; 5-я и 6-я пары акроцентриков группы В близки по размеру 2-й и 3-й па­рам хромосом группы А. Хромосомы 7, 8 и 9-й пар значительно короче.

К группе С относят шесть пар (с 10-й по 15-ю включительно) субметацентрических хромосом среднего размера. Они примерно одинаковой длины и трудно отличимы друг от друга.

К группе D относят четыре пары (с 16-й по 19-ю включитель­но) метацентрических хромосом с плечами равной длины; 16-я пара отличается от других метацентриков наличием на одном из плечей вторичной перетяжки; 17-я и 18-я пары трудно отличимы

друг от друга; 19-я пара — это половые хромосомы. Они достаточ­но четко отличаются от других хромосом: Х-хромосома самая крупная из всех метацентриков, а 7-хромосома самая маленькая из них.

Задание 3. Постройте кариограмму хряка: вырежьте ножница­ми из микрофотографии все хромосомы и классифицируйте их по группам согласно рисунку 6.

Найдите парные (гомологичные) хромосомы. Убедитесь, что все хромосомы распределены по гомологичности, приклейте их микрофотографии в тетрадь по группам. Сравните построенную вами кариограмму со стандартной (выявите возможные отклоне­ния по числу хромосом или форме отдельных хромосом).

Задание 4. Изучите кариотип крупного рогатого скота. Класси­фицировать данные хромосы трудно, так как аутосомы (29 пар) не отличаются друг от друга по положению центромеры (все они от­носятся к акроцентрикам, рис. 7). Подсчитайте хромосомы и по­стройте кариограмму согласно убыванию размеров хромосом, вы­делите половые хромосомы согласно рисунку 8.

В диплоидном наборе лошади 64 хромосомы (32 пары). По длине и положению центромеры хромосомы лошади подразделя­ются на шесть групп (А, В, С, D, E, F) (рис. 9).

Группа А содержит 14 крупных метацентрических хромосом у женского и 13 у мужского пола.

Группа В представлена четырьмя парами крупных метацентри­ков, 7-я и 8-я пары имеют субмедиально локализованные центро­меры.

Группа С состоит из шести пар крупных акроцентрических хро­мосом.

Группа D содержит шесть пар акроцентрических хромосом по­степенно уменьшающихся размеров.

Группа Е включает три пары мелких метацентрических хромо­сом, которые различаются по длине и положению центромеры.

Группа F содержит шесть пар мелких акроцентрических хромосом. Две пары этой группы имеют характерные вторичные перетяжки.

Задание 5. Изучите кариотип домашней лошади. Постройте ка- риограмму лошади, для чего: а) вырежьте ножницами из микрофо­тографии все хромосомы и классифицируйте их по группам; б) най­дите парные гомологичные хромосомы, выделите половые хромо­сомы согласно рисунку 6, наклейте их в тетрадь.

В кариотипе овец три пары аутосом — крупные метацентрики, 23 пары — акроцентрики. Половые: Д-хромосома — крупный ак- роцентрик; 7-хромосома — самый мелкий элемент набора.

Задание 6. Изучите особенности кариотипов овец. Постройте кариограмму: вырежьте из микрофотографии все хромосомы, классифицируйте их согласно рисунку 10, наклейте в тетрадь.

В кариотипе козы (2n = 60) все аутосомы (29 пар) акроцентри- ческого типа. Половая Х-хромосома — одна из наиболее крупных акроцентриков, 7-хромосома — самая маленькая, субметацентри­ческого типа.

Задание 7. Изучите особенности кариотипов коз. Постройте ка­риограмму козла: вырежьте ножницами из микрофотографии все хромосомы и классифицируйте их; найдите гомологичные хромо­сомы, выделите половые хромосомы согласно рисунку 11, наклей­те их в тетрадь.

Хромосомы птиц являются наиболее трудными цитологиче­скими объектами по сравнению с хромосомами млекопитающих. В клетках тканей кур содержится в диплоидном наборе 78 хромо­сом (39 пар), резко отличающихся по величине. Их можно разде­лить на три группы.

Группа А (макрохромосомы) включает пять пар хромосом (I—V). Их нумерация соответствует убывающей длине. Самые большие хромосомы — первые пары — хотя и относятся к субметацентри­ческому типу, но по длине плеча различаются незначительно. На некоторых метафазных пластинках они могут казаться почти рав­ноплечими.

II пара — субметацентрические хромосомы, существенно раз­личаются по длине плеч.

III пара — крупные хромосомы акроцентрического типа. По длине они равны длине большого плеча хромосомы 2.

IV пара — субметацентрики, они почти такие же по длине, как и III пара, но отличаются по расположению центромеры.

V пара — половые хромосомы (Z-хромосомы). Они отличаются от всех аутосом, так как являются метацентрическими. У птиц в

отличие от млекопитающих мужской пол гомогаметный (ZZ), а женский — гетерогаметный (ZW).

Группа В (субмакрохромосомы) включает шесть пар аутосом среднего размера (VI—XI пары). Из них хромосомы первых трех пар — акроцентрические, а последних трех — метацентрические.

Группа С состоит из очень мелких хромосом (микрохромосом) овальной, иногда почти шарообразной формы. Дифференциро­вать их в настоящее время не представляется возможным.

Задание 8. Отметьте особенности кариотипа домашней птицы (кур) (рис. 12).

Задание 9. Изучите классификацию и типы хромосом у домаш­них животных (кошек, собак) (рис. 13, 14).

Задание 10. По микрофотографиям измерьте хромосомы и сде­лайте расчеты плечевого и центромерного индексов.

Задание 11. Сравните кариотипические особенности основных видов сельскохозяйственных и домашних животных и птицы, оформите их в виде таблицы 1.

Название книги — Практикум по ветеринарной генетике

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *